第七章病毒分离鉴定

第七章病毒分离鉴定第1页，共50页，2023年，2月20日，星期一病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体潜伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见最多查见很难查见未增多未增多或增多不明显明显增多（常超过4倍）第2页，共50页，2023年，2月20日，星期一一、标本的处理（一）除菌处理

粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。第3页，共50页，2023年，2月20日，星期一（二）研磨和稀释对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（pH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织悬液，然后经2000转／分离心20分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。第4页，共50页，2023年，2月20日，星期一

病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。二、病毒的分离培养第5页，共50页，2023年，2月20日，星期一(一）动物接种法接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。第6页，共50页，2023年，2月20日，星期一动物接种的优缺点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；（2）技术简单；（3）易成功缺点：（1）个体差异大（2）价格昂贵（3）数量有限（4）需要隔离畜舍第7页，共50页，2023年，2月20日，星期一（二）鸡胚接种1.鸡卵的选择

一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。2.孵育

孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。第8页，共50页，2023年，2月20日，星期一3.检卵

鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。（1）未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。（2）活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。第9页，共50页，2023年，2月20日，星期一（3）死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。

鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。第10页，共50页，2023年，2月20日，星期一鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查（图7-8）。常用于流感病毒的初次分离。鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查（图7-7）。常用于某些嗜神经病毒的分离。4.接种第11页，共50页，2023年，2月20日，星期一绒毛尿囊膜接种：用10～l2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开—小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上．孵育后。观察膜上有无斑点病变(图7-10)。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查(图7-9),常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。第12页，共50页，2023年，2月20日，星期一5.剖检及收获收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。第13页，共50页，2023年，2月20日，星期一鸡胚接种的优缺点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。第14页，共50页，2023年，2月20日，星期一(三）细胞培养根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种。细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。

第15页，共50页，2023年，2月20日，星期一原代细胞培养即从机体内取出细胞置试管或瓶内生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病毒疫苗.这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和传代,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和地鼠肾原代细胞。传代细胞它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的,染色体数为非整倍体,细胞随时可以获得,生长迅速,可无限传代.第16页，共50页，2023年，2月20日，星期一细胞培养的方法静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。第17页，共50页，2023年，2月20日，星期一组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。

病毒的获得第18页，共50页，2023年，2月20日，星期一优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；无个体差异，准确性和重复性好；可严格执行无菌操作；细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；应用空斑技术可进行病毒的克隆化。第19页，共50页，2023年，2月20日，星期一三、病毒鉴定1.形态学鉴定细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落，这些改变称为细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）。CPE出现的时间也是鉴定病毒的标志之一。第20页，共50页，2023年，2月20日，星期一细胞病变正常细胞细胞折光性↑，变圆○，局部→全层，死亡脱落，如：肠道病毒第21页，共50页，2023年，2月20日，星期一细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒。第22页，共50页，2023年，2月20日，星期一细胞融合现象病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。第23页，共50页，2023年，2月20日，星期一细胞融合现象第24页，共50页，2023年，2月20日，星期一包涵体定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。第25页，共50页，2023年，2月20日，星期一包涵体的性质病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体；大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体；细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体。第26页，共50页，2023年，2月20日，星期一第27页，共50页，2023年，2月20日，星期一第28页，共50页，2023年，2月20日，星期一胞浆内有空泡形成，如：猴病毒SV40、呼肠孤病毒等。第29页，共50页，2023年，2月20日，星期一感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用2.血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。第30页，共50页，2023年，2月20日，星期一红细胞吸附正常细胞（1）血吸附作用吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒。第31页，共50页，2023年，2月20日，星期一（2）血凝作用血凝试验血凝抑制试验有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合.第32页，共50页，2023年，2月20日，星期一四、电子显微镜检查

病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。第33页，共50页，2023年，2月20日，星期一透射电子显微镜

第34页，共50页，2023年，2月20日，星期一1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化锇清洗与脱水浸透包埋聚合切片染色铀染铅染第35页，共50页，2023年，2月20日，星期一鸡痘病毒（超薄切片）第36页，共50页，2023年，2月20日，星期一超薄切片法的优缺点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存第37页，共50页，2023年，2月20日，星期一2.负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。铜网样品

滤纸1-2分钟后电镜观察染液（常用磷钨酸）第38页，共50页，2023年，2月20日，星期一口蹄疫病毒的电镜负染第39页，共50页，2023年，2月20日，星期一负染法的优缺点：优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态第40页，共50页，2023年，2月20日，星期一免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。

3.免疫电镜技术(Immuneelectronmicroscopy，IEM)第41页，共50页，2023年，2月20日，星期一（1）免疫凝集电镜技术抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。第42页，共50页，2023年，2月20日，星期一（2）免疫电镜定位技术特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。

酶标记染色

第43页，共50页，2023年，2月20日，星期一五、血清学试验

是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。第44页，共50页，2023年，2月20日，星期一virus1.中和反应观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。第45页，共50页，2023年，2月20日，星期一2.补体结合反应

AgAb红细胞溶血素补体AbAg红细胞补体溶血素溶血（-）不溶血（+）第46页，共50页，2023年，2月20日，