极性C亲水作用色谱强极性化合物分离专题

极性C亲水作用色谱强极性化合物分离专题第1页/共44页强极性小分子分析难点1.我的样品是两性极性小分子化合物，反相柱不保留，怎样选择合适的色谱柱分析。关键词：不保留2.我的样品分析条件比较特殊，必须要进行质谱检测，要选择可以进质谱的分析条件。关键词：质谱兼容第2页/共44页强极性小分子分析难点中强极性化合物强极性化合物一般极性化合物普通反相模式C18/C8可解决部分化合物在纯水条件下反相模式解决在反相上无保留，正相不溶解，难点问题：疏水塌陷问题：不保留，不溶解第3页/共44页强极性小分子分析解决方案C18甲醇中C18水中第4页/共44页强极性小分子分析解决方案选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾避免疏水塌陷的几个策略选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾选用链长更长的烷基固定相选用大孔硅胶对烷基链固定相进行极性基团嵌入的改造第5页/共44页强极性小分子分析解决方案一步法反应较好保持了烷基链的疏水性可调的极性基团种类和数量增加了材料的稳定性Polar-copolymerized极性共聚Polar-embeded极性包埋Polar-endcapped极性封尾破坏了烷基链的疏水性两步反应，极性基团数量不可控利用极性共聚技术研发出耐水的XAqua系列色谱柱第6页/共44页强极性小分子分析解决方案停流实验第7页/共44页强极性小分子分析解决方案原儿茶醛色谱条件：色谱柱：XAquaC18(150×4.6mm，5mm)流动相：乙腈：1%醋酸水溶液=5:95；柱温：30°C;流速:1.0mL/min;第8页/共44页强极性小分子分析解决方案小分子酸色谱条件：色谱柱：XAquaC18；流动相：100%（0.1%三氟乙酸水）；第9页/共44页强极性小分子分析解决方案中性或酸性极性小分子化合物XAqua系列碱性极性小分子化合物★解决XAqua系列拖尾一般解决办法流动相中加入离子对试剂质谱不兼容第10页/共44页强极性小分子分析解决方案碱性化合物拖尾的原因，残余硅醇基与碱性化合物作用造成拖尾针对碱性化合物，研发出专用碱性化合物的分离分析的色谱柱XCharge

系列设计理念：合理控制电荷密度，形成恰当的电荷屏蔽层，消除硅醇基的拖尾影响，实现载样量的提升。第11页/共44页强极性小分子分析解决方案羟氨苄青霉素色谱条件：色谱柱：XChargeC18；流动相：A0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇；梯度：0~20min，5%B~95%B第12页/共44页强极性小分子分析解决方案磺胺类碱性小分子色谱条件：色谱柱：XChargeC18；流动相：A0.1%甲酸水，B乙腈；梯度：0~30min，5%B~95%B第13页/共44页强极性小分子分析解决方案超强极性怎么办，反相纯水条件下不保留HILIC

模式XAquaC18流动相：100%水XAmide流动相：85%乙腈水第14页/共44页强极性小分子分析解决方案增加保留与反相不同保留机理正交性更好的溶解度和质谱兼容性第15页/共44页强极性小分子分析解决方案色谱柱：XAmino，250mm×4.6mm，5mm流动相：A:乙腈B：水等度：A/B=85:15流速：1.0mL/min柱温：35oC选择性：1.12分离度：3.08甘露醇山梨醇第16页/共44页强极性小分子分析解决方案色谱柱：XAmide，250mm×4.6mm，5mm流动相：A:磷酸盐缓冲液B：乙腈等度：A/B=30:70流速：1.0mL/min柱温：35oC左旋肉碱第17页/共44页强极性小分子分析解决方案未知极性小分子化合物XAquaC18拖尾XChargeC18XAmideS-ClickXIon不保留拖尾反相模式亲水模式方案特点1.该方案基本适用于所有极性小分子化合物，普试性好。2.该方案所有流动相都可应用于质谱，质谱兼容性好。3.采用两种模式，增加了样品的选择性。第18页/共44页强极性小分子分析解决方案样品1样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAquaC18100%甲酸水XChargeC18100%甲酸水S-ClickXIon乙腈甲酸铵体系放大图拖尾不保留保留好，分离好第19页/共44页强极性小分子分析解决方案样品2样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAquaC18乙腈甲酸水主峰纯度96.55%S-ClickXIon乙腈甲酸水主峰纯度84.91%分离度差保留适中分离度良好第20页/共44页强极性小分子分析解决方案样品3样品为某CRO公司提供合成中间体小分子化合物XAquaC18100%甲酸水主峰纯度96.55%XChargeC18100%甲酸水主峰纯度96.55%分离度差保留弱分离度差保留适中分离度良好第21页/共44页22亲水作用色谱与中药中强极性化合物的分离专题讲座第22页/共44页主要内容亲水作用色谱保留机理及特点亲水作用色谱影响因素及应用中药中强极性化合物的分离研究方向第23页/共44页强极性化合物的分离反相色谱正相色谱溶解度与质谱联用？A.J.Alpert,J.Chromatogr.,499(1990)177.亲水作用色谱HILIC亲水作用色谱机理及特点第24页/共44页亲水作用色谱亲水作用色谱法的分离原理与正相色谱法相近的极性固定相、以高比例极性有机溶剂和低比例水的混合溶液为流动相，主要用于极性化合物的分离。被分析物质在色谱柱中的保留和其自身的极性成正比，和流动相的极性成反比。被分析物质的极性越强，在色谱柱中保留越强。增加流动相中水的比例，使流动相极性增强，则分析物保留减弱。第25页/共44页亲水色谱固定相(1)传统的正相色谱固定相，包括纯硅胶固定相、氨基键合相、二醇基键合相、氰基固定相。该类固定相对糖、有机酸、核苷等强极性化合物表现出良好的分离选择性;(2)离子交换固定相，该类固定相具有很好的亲水性，表面带有较强的表面电荷，用于亲水作用色谱时表现为一种离子交换(或排斥)/亲水作用混合色谱模式;(3)专门应用于亲水作用色谱的固定相，包括酰胺类固定相、醇羟基固定相和两性离子固定相。酰胺类固定相可用于分离核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有机酸等亲水化合物;醇羟基固定相适合于分离各种糖，如单糖、二糖、糖醇、寡糖及碱基、核苷、肽和中药中的强极性组分。第26页/共44页强极性化合物反相模式分离ODSColumn1.000mL/minA:0.1%

甲酸/水B:

乙腈时间/分钟03050B/%53070亲水作用色谱机理及特点川芎强极性成分反相模式分离，UV检测（260nm）第27页/共44页吸附亲水作用色谱保留机理亲水作用色谱机理及特点分配极性固定相富水层流动相极性固定相溶质A.J.Alpert,J.Chromatogr.,499(1990)177.Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71Y.Guo,J.Pharm.Biomed.Anal.31（2003）1191T.Yoshida,J.Biochem.Biophys.Meth.60（2004）265第28页/共44页反相液相色谱正相液相色谱毛细管电色谱离子对色谱亲水作用色谱特点HILIC强极性组分亲水作用色谱机理及特点好的保留好的溶解度流动相简单大的制备规模第29页/共44页亲水作用色谱影响因素固定相有机溶剂缓冲盐pH柱温亲水作用色谱影响因素及应用第30页/共44页(A)KeystoneCarbohydrate,(B)AsahipakNH2P,(C)BetaBasicCyano,(D)MetasilCyano,(E)TSKGelAmide-80,(F)CyclobondIII,(G)PolyhydroxyethylAspartamide0-40min，ACN：90-75%；40-80min，ACN：75%terreicacidoosporeinguanine

nocardicinAcephalosporinCvancomycin固定相对亲水模式分离的影响M.A.Strege,

Anal.Chem.70(1998)2439亲水作用色谱影响因素及应用第31页/共44页有机溶剂对亲水模式分离的影响(1)epidaunorubicin,(2)daunorubicin,(3)epirubicin,(4)doxorubicinKromasilKR100-5SIL10%HCOONabuffer(20mM,pH2.9)R.P.Li,J.Chromatogr.A,1041(2004)163亲水作用色谱影响因素及应用第32页/共44页有机溶剂对亲水模式分离的影响aspirincytosineTSKgelAmide-80YMC-PackNH2HILICSilica×ZIC-HILIC5mMammoniumacetate，30℃Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71亲水作用色谱影响因素及应用第33页/共44页缓冲盐对亲水模式分离的影响亲水作用色谱影响因素及应用terreicacidoosporeinguanine

nocardicinAcephalosporinCvancomycinA:6.5mM三氟乙酸；B:7.9mM甲酸铵pH4.4C:6.5mM乙酸铵pH5.5；D:6.3mM碳酸氢铵pH7.9TSKGelAmide80column0-40min，ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%M.A.Strege,

Anal.Chem.70(1998)2439第34页/共44页pH对亲水模式分离的影响RetentionofBTEACasafunctionofpHAtlantissilica85%ACN-0.1MNH3pHadjustedwithformicacidACN–0.1MHCOONH4,

pH8.2–10.2D.V.McCalleyJ.Chromatogr.A1171（2007）46AnalysisoftestsolutesonAtlantissilica亲水作用色谱影响因素及应用第35页/共44页柱温对亲水模式分离的影响aspirincytosineTSKgelAmide-80YMC-PackNH2HILICSilica×ZIC-HILICACN/water:90/10(10mMammoniumacetate)Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71亲水作用色谱影响因素及应用第36页/共44页亲水作用色谱应用血浆中叶酸化合物的检测NestGroupHILICcolumn，乙腈/水（75：25）5mM乙酸铵，pH6.9S.D.Garbis，Anal.Chem.73（2001）5358亲水作用色谱影响因素及应用第37页/共44页单糖、寡糖分离单糖、二糖分离氰基柱乙腈/水/甲酸铵

(240mM,pH3.0)76:23:1麦芽寡糖分离氨基柱乙腈/水/甲酸铵

(240mM,pH3.0)70:29:1A.H.Que，Anal.Chem.74（2004）5184

亲水作用色谱影响因素及应用第38页/共44页糖基磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI-APs）分离（A）HILICeluate；（B）PNGaseF-treatedHI