普通微生物学

普通微生物学第1页/共115页第一节微生物生长的测定微生物生长的概念及常规测定方法（原理和操作）第二节细菌的群体生长繁殖细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念和方法）各种常见物理、化学因素对微生物生长的影响第三节微生物生长繁殖的控制第2页/共115页生长：繁殖：细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。微生物生长到一定阶段由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。参见P132第3页/共115页生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于个体微小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。参见P132第4页/共115页一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例生长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加群体内各个个体进一步生长群体的生长第5页/共115页个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖微生物生长：在一定时间和条件下，细胞数量的增加（微生物群体生长）在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。第6页/共115页大肠杆菌一个细胞重约10-12克，平均20分钟繁殖一代24小时后：4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨48小时后：2.2×1043个后代，重量达到2.2×1025吨相当于4000个地球的重量一头500kg的食用公牛，24小时生产0.5kg蛋白质，而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24小时可以生产50000kg优质蛋白质。第7页/共115页第一节微生物生长的测定微生物生长的概念及常规测定方法（原理和操作）第8页/共115页微生物生长：单位时间内微生物数量或生物量（Biomass）的变化微生物生长的测定个体计数生物量测定重量测定生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；参见P151第9页/共115页一、计数法参见P152通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。1、培养平板计数法对样品进行适当稀释单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖肉眼可见的菌落对菌落数目计数推测样品中的微生物细胞数第10页/共115页第11页/共115页由于无法保证细菌细胞在分离过程中彻底分开，因此，一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数（个）。菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）：

采用菌落计数时，由于不能绝对保证一个菌落只是由一个活细胞形成，计算出的活细胞数称为CFU。CFU并不完全等同于样品中的活菌数。第12页/共115页第13页/共115页第14页/共115页第15页/共115页采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复，取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；第16页/共115页第17页/共115页第18页/共115页2、膜过滤培养法如何对菌数低的样品，如水，中的细菌数量进行计数？菌数低的样品膜过滤培养菌落计数参见P153第19页/共115页水中细菌总数：124cfu/100ml第20页/共115页第21页/共115页3、显微镜直接计数法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。参见P152第22页/共115页1）常规方法缺点：

不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌的计数；

需要相对较高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察。第23页/共115页2）其它方法比例计数:已知浓度的样品（如血液）+待测浓度的样品；显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。过滤计数:菌数低的样品（如水）膜过滤对细菌进行荧光染色荧光显微镜计数活菌计数:采用特定的染色技术对活菌和死菌分别计数第24页/共115页二、生物量测定1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（opticaldensity，即O.D.）表示菌量。测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的范围内，否则不准确。参见P153第25页/共115页2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸的测定间接推算微

生物群体的生物量。测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法参见P153第26页/共115页3、生理指标法参见P154生理指标：呼吸强度耗氧量酶活性生物热等，与其群体的规模成正相关第27页/共115页第二节细菌的群体生长繁殖细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念和方法）参见P134第28页/共115页微生物的特点：个体微小除真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个微生物组成的群体。微生物的接种是群体接种，接种后的生长是群体繁殖生长对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础参见P134第29页/共115页一、生长的规律在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。生长曲线（growthcurve）：细菌接种到定量的液体培养基（封闭系统）中，定时取样测定细胞数量，以时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线第30页/共115页第31页/共115页细菌的生长曲线一般以菌数的对数为纵坐标作图第32页/共115页第33页/共115页第34页/共115页1、迟缓期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加或增加很少，生长速度几近于零，也称延迟期、适应期第35页/共115页迟缓期细胞的特点：细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末细胞的平均长度比刚接种时长6倍。通常处于迟缓期的细菌细胞最大。细胞内RNA，尤其是rRNA含量高，合成代谢活跃。核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。分裂迟缓，代谢活跃以上特征说明，细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。第36页/共115页迟缓期出现的原因：调整代谢微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏能量和必需的生长因子，“种子”老化（即处于非对数生长期）或未充分活化，接种时造成的损伤等。调整代谢需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄及移种前后所处的环境等因素有关，有的只需几分钟，有的需要几小时。第37页/共115页在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：通过遗传学方法改变菌种的遗传特性利用对数生长期的细胞作为“种子”尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大适当扩大接种量第38页/共115页2、对数生长期也称指数生长期（exponentialphase）第39页/共115页代时（generationtime）：在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，通常以G表示。倍增时间（doublingtime）：在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间。参见P137

t－t0

G=－－－－－－－－－

3.322（lgNt

－lgN0)第40页/共115页第41页/共115页影响微生物代时的因素：1）菌种，不同的微生物及同一微生物的不同菌株代时不同；2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度成正比；4）温度，在一定范围内，生长速率与温度成正相关；第42页/共115页在一定范围内，生长速率与温度成正相关参见P149第43页/共115页不同的微生物有不同的最适生长温度范围第44页/共115页3、稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活菌数量最高并维持稳定。营养物质消耗、代谢产物累积和pH等环境变化环境条件逐步不适于细菌生长细菌生长速率降低直至零（细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量）第45页/共115页对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段：1）开始储存糖原等内含物2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段

某些放线菌抗生素的大量形成也在此期第46页/共115页稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关生产上延长稳定期的方法：

补充营养物质（补料）或取走代谢产物

调节pH、调节温度

对好氧菌进行通气、搅拌或振荡获得更多的菌体物质或代谢产物第47页/共115页营养物质耗尽或有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。

死亡的细菌以对数方式增加，但由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡速率降低，在衰亡期的后期仍会有部分活菌存在。4、衰亡期（decline或deathphase）第48页/共115页衰亡期的特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物，如氨基酸、抗生素、外肽酶等；菌体细胞也呈现多种形态，有时出现畸形，细胞大小悬殊。有些革兰阳性菌此时染色呈革兰阴性。第49页/共115页不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用（如葡萄糖或NH4+等）；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两种碳源（或氮源）时，微生物生长过程中会形成二次生长现象。第50页/共115页第51页/共115页第52页/共115页第53页/共115页第54页/共115页第55页/共115页二、同步培养理想的实验材料：群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。同步生长同步培养（synchronousculture）：使群体中的细胞进行同步生长的培养技术通过同步培养的方法获得的细胞称为同步细胞或同步培养物参见P138第56页/共115页机械法环境条件控制技术离心法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成分控制其他（如光照和黑暗交替培养）同步培养物：一种理想的材料生理与遗传特性研究工业发酵的种子第57页/共115页由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐演变为随机生长。第58页/共115页三、连续培养将微生物置于一定体积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）或封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。迟缓期、对数期稳定期、衰亡期连续培养（continuousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。在培养过程中不断地补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。第59页/共115页控制连续培养的方法恒浊器连续培养恒化器连续培养不断调节流速，使培养液浊度保持恒定保持恒定的流速第60页/共115页（一）恒浊器连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的速率使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度上升；恒浊器培养的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。第61页/共115页一般用于菌体以及菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业（连续发酵）连续发酵与单批发酵相比的优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化第62页/共115页（二）恒化器连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下生长进行繁殖。第63页/共115页恒化器连续培养中，必须将某种必需的营养物质控制在较低浓度，以限制生长速度，而其他的营养物质均过量。细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率。限制性因子必须是机体生长必不可少的营养物质，如氨基酸、铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源，或者是无机盐、生长因子等物质。因而可在一定浓度范围内决定该机体生长速率。第64页/共115页通过控制流速可以得到生长速率不同但浓度基本恒定的培养物主要用于：科研遗传学：突变株的分离生理学：不同条件下的代谢变化生态学：模拟自然营养条件建立实验模型第65页/共115页第三节微生物生长繁殖的控制各种常见的物理、化学因素对微生物生长的控制（原理和方法）第66页/共115页抑制（inhibition）：生长停止，但不死亡；死亡（death）：生长能力不可逆丧失；防腐（antisepsis）：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长；消毒（disinfection）：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；灭菌（sterilization）：杀死包括芽孢在内的所有微生物；化疗（chemotherapy）：杀死或抑制宿主体内的病原微生物或病变细胞；参见P160第67页/共115页控制微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。第68页/共115页理化因子是抑菌还是杀菌作用的相关因素：理化因子的强度或浓度同一浓度理化因子作用时间的长短不同种类的微生物同一种微生物不同生长时期参见P154第69页/共115页一、控制微生物的化学物质抗微生物剂抗代谢物抗生素控制微生物的化学物质第70页/共115页1、抗微生物剂一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质抗微生物剂（antimicrobialagent）生物合成的天然产物人工合成的化合物第71页/共115页化学物质的抗微生物能力的测定液体培养法平板培养法最低抑制浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）实验抑菌环/圈（zoneofinhibition）实验第72页/共115页第73页/共115页杀菌？抑菌？化学物质的抗微生物能力的测定液体培养法平板培养法通过这两种方法无法区分抗微生物剂的作用效果第74页/共115页待测化学物质对数生长培养物定时测定总菌数和活菌数抑菌剂（bacteriostaticagent）杀菌剂（batericide）溶菌剂（bacteriolysis）第75页/共115页抗微生物剂消毒剂（disinfectant）防腐剂（antiseptics）第76页/共115页防腐剂与消毒剂特点：对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗。消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：可杀死微生物或抑制其生长，但对于动物或人体的组织

无毒害作用，可作为外用抗微生物药物。第77页/共115页使微生物蛋白质凝固变性,如酒精等；

破坏菌体的酶系统,如过氧化氢等；

增加细胞膜的通透性,使细胞发生破裂或溶解.

如来苏儿等酚类物质。作用机理：第78页/共115页

消毒剂广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌。温度计、带透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等；墙壁、楼板、仪器设备等表面和自来水；空气防腐剂通常作为人体的外用品！第79页/共115页第80页/共115页各种抗微生物剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数=待测制剂最高稀释度达到同效的石炭酸的最高稀释度在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸一般规定：处理时间为10分钟，供试菌为Salmonellatyphi（伤寒沙门菌）由于各种抗微生物剂的杀菌机制各不相同，故石炭酸系数仅有一定的参考价值。第81页/共115页2、抗代谢物（antimetabolite）一类化合物：与必需的代谢物具有相似的结构

可和特定的酶结合

阻碍酶的功能

干扰代谢的正常进行叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-FU）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）第82页/共115页磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学治疗剂，抗菌谱广，能治疗多种感染性疾病。大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎链球菌、溶血性

链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用第83页/共115页1934年，德国I.G.Farben染料厂的G.Domagk一种红色染料（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗链球菌感染，但在体外无作用。1935年，进一步证明protosil对人链球菌感染也有效。1935年除，Domagk唯一的女儿因伤口感染濒于死亡，在绝望中Domagk将尚未经过临床试验的prontosil注射到女儿体内，结果挽回了女儿的生命。法国人Trefuel和英国人Fuller证实：

在体内prontosil转化成了具有抑菌作用的磺胺。第84页/共115页作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物很多细菌需要自己合成叶酸才能生长磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶——二氢叶酸合成酶，不能用外界的对氨基苯甲酸合成叶酸，必须直接利用叶酸作为生长因子进行生长。第85页/共115页第86页/共115页第87页/共115页3、抗生素（antibiotic）第88页/共115页抗生素：某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。自上世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅有几十种。第89页/共115页1）作用机制：抑制细菌细胞壁的合成

破坏细胞质膜

作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化

抑制蛋白质和核酸的合成抑制微生物的生长或杀死它们第90页/共115页第91页/共115页第92页/共115页第93页/共115页第94页/共115页第95页/共115页青霉素青霉素的β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法相互连接，抑制了细胞壁的合成。第96页/共115页由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的抗生素抗菌谱各异。第97页/共115页2）细菌抗药性的产生第98页/共115页抗性菌株的特点：细胞质膜透性改变，使抗生素不能进入细胞或进入后被细胞主动排出；药物作用靶改变；合成了修饰抗生素的酶；抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体；第99页/共115页一、控制微生物的物理因素杀死或抑制微生物的物理因素温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波第100页/共115页1、温度当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。第101页/共115