时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析第1页/共37页发展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖第2页/共37页一、时间分辨荧光免疫分析特点第3页/共37页1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间第4页/共37页常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714μs非特异性荧光背景1-10ns人血清白蛋白4.1ns人球蛋白、血红蛋白3.0ns细胞色素C3.5nsFITC4.5ns丹磺酰氯14ns苯胺萘磺酸16ns稀土螯合物104-106ns第5页/共37页2.Stokes位移大

荧光物质激发波长发射波长Stokes位移Eu-(β-NTA)3340nm613nm273nmSm-(β-NTA)3340nm600nm260nmTb-(PTA)3295nm490/543nm195/248nmDy-(PTA)3295nm573nm278nm第6页/共37页镧系元素发射峰窄第7页/共37页优点灵敏度高（10-18mol/孔）原子标记多标记技术第8页/共37页二、时间分辨荧光免疫分析体系非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析第9页/共37页（一）非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相免疫分析解离增强荧光免疫分析酶放大免疫分析第10页/共37页1.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高第11页/共37页实例加拿大CyberFluor的FIAgen系统Eu3+-BCPDA为标记物第12页/共37页2.解离增强分析原理示意图第13页/共37页（1）双功能螯合剂EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接近中性时，螯合物足够稳定酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放Eu-DTTA应用最广泛第14页/共37页（2）增强液增强原理图一般增强百万倍第15页/共37页β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物TOPO：荧光增强协同剂TritonX-100：表面活性剂，形成胶束醋酸：酸性介质第16页/共37页（3）酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物ALP第17页/共37页酶放大免疫分析示意图第18页/共37页双标记测定AFP和β-hCGβ-NTA作为螯合剂340nm激发，Eu:615nm,820μs；Sm:643nm,88μs第19页/共37页（二）均相免疫分析基于时间分辨荧光共振能量转移无需洗涤、分离、加增强液第20页/共37页TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射615nm，供体APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体能量转移效率最高的供体/受体对第21页/共37页时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图第22页/共37页三、时间分辨免疫分析方法夹心法竞争法间接法捕获法生物素-亲和素放大法第23页/共37页1.夹心法双抗体夹心法第24页/共37页双抗原夹心法第25页/共37页2.竞争法第26页/共37页3.间接法间接法测定HCV抗体第27页/共37页4.捕获法捕获法测定抗-CMVIgM第28页/共37页5.生物素-亲和素法生物素-亲和素检测PAPP-A第29页/共37页四、应用1.肿瘤标志物检测2.传染病检测3.糖尿病检测4.激素检测5.细胞活性检测第30页/共37页1.肿瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法固相包被抗体加入样品或标准品加入Eu标记抗体加入增强液测定荧光灵敏度：0.17U/ml第31页/共37页2.传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育加入铕标记抗原，孵育加入增强液，检测荧光符合中国药品生物制品鉴定所结果第32页/共37页3.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法抗体包被微孔板加入标准品或样品加入铕标记抗体增强液，检测荧光灵敏度：0.08ng/ml第33页/共37页4.激素检测三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法微孔板中加入抗体标准品或样品、铕标记T3加入增强液，测定荧光灵敏度：0.21ng/ml第34页/共37页5.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞E：效应细胞第35页/共37页NK细胞活性靶细胞：K