制备柱注意事项

HPLC的常用术语1、 色谱图(chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、 (色谱)峰(chromatographicpeak)：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。此主题相关图片如上：3、 峰底(peakbase)：峰的起点与终点之间的连接的直线(图1中的CD)。4、 峰高(h，peakheight)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1中的BE)。5、 峰宽(W，peakwidth)：在峰两侧拐点(图1中的F,G)处所作切线与峰底相交两点的距离(图1中的KL)。6、 半高峰宽(Wh/2，peakwithdathalfheight)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1中的HJ)。7、 峰面积(A，peakarea)：峰与峰底之间的面积(图1中的CHEJDC)。8、 拖尾峰(tailingpeak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、 前伸峰(leadingpeak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)10、 假峰(ghostpeak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)11、畸峰(distrortedpeak)：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。12、 反峰(negativepeak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。14、 原点(origin)：纸或薄层板上滴加试样部位的中心点(图2)。15、 斑点(spot)：平面色谱法中，组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区(图2)。16、 区带(zone)：在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。17、 复斑(multiplespot):一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。18、 区带拖尾(zonetailing):由于物理、化学等作用的影响，一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。19、 基线(baseline):在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。20、 基线漂移(baselinedrift):基线随时间定向的缓慢变化。21、 基线噪声(N，baselinenoise):由于各种原因而引起的基线波动。22、 统计矩(moment):色谱流出曲线是组分在检测器中浓度或质量依时间的统计分布曲线，响应值对应于分布密度。组分在柱内迁移时间r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶原点矩。而组分在柱内迁移时间与平均迁移时间差的r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶中点矩。23、 一阶原点矩(firstoriginmoment):组分在柱内迁移时间的数学期望。当流出曲线为对称峰时，即为组分的保留时间。24、二阶中心矩( µ2，secondcentralmoment):二阶中心矩为流出曲线的方差。定义为：µ2=E(t-Et)2式中，E代表平均。25、 三阶中心矩(µ3，thirdcentralmoment)：定义为：µ3=E(t-Et)3可以表示流出曲线的不对称程度。峰形对称时µ3=0，前伸峰µ3<0 ，拖尾峰µ3>0。第二部分分离模式1、 液相色谱法(liquidchromatography，LC)：用液体作流动相的色谱法。2、 液液色谱法(liquidliquidchromatography，LLC)：将固定液涂渍在载体上作为固定相的液相色谱法。3、 液固色谱法(liquidsolidchromatography，LSC)：用固体(一般指吸附剂)作为流动相的液相色谱法。4、 正相液相色谱法(normalphaseliquidchromatography，NPLC):固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。5、 反相液相色谱法(reversedphaseliquidchromatography,RPLC)：固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。6、 柱液相色谱法(liquidcolumnchromatography)：在柱管内进行组分分离的液相色谱法。7、 高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)：具有高分离效能的柱液相色谱法。8、 尺寸排除色谱法(sizeexclusionchromatography,SEC)：用化学惰性的多孔性物质作为固定相，试样组分按分子体积(严格来讲是流体力学体积)进行分离的液相色谱法。9、凝胶过滤色谱法：(gelfiltrationchromatography)：水或水溶液作为流动相的体积排除色谱法。10、 凝胶渗透色谱法：(gelpermeationchromatography,GPC)：有机溶剂作为流动相的体积排除色谱法。11、 亲和色谱法(affinitychromatography)：用连接在基体上的配位体做固定相，使其与蛋白质或其他大分子发生可逆的高选择性的相互作用，利用不同亲和力进行分离的液相色谱法。12、 离子交换色谱法(ionexchangechromatography,IEC)：以离子交换作用分离离子型化合物的液相色谱法。13、 离子色谱法(ionchromatography)：以含有某种特定离子的水溶液作为流动相，流出液通过抑制柱(或不通过抑制柱)，在降低流动相背景信号的条件下用于分离离子的液相色谱法。14、 离子抑制色谱法(ionsuppressionchromatography)：通过调节流动相的PH值来抑制试样组分的电离，以分离离子型化合物的液相色谱法。15、 离子对色谱法(ionpairchromatography)：用形成离子对化合物进行分离的液相色谱法。16、疏水作用色谱法(hydrophobicinterationchromatography):用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相,借疏水作用分离生物大分子化合物的液相色谱法。17、 制备液相色谱法(preparativeliquidchromatography):用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化合物的液相色谱法。18、 平面色谱法(planarchronatography):在平面介质上进行组分分离的色谱法，也叫平板色谱法。<<常用术语>>A：吸收度(式3.1,3.2)；也作面积ACN：乙腈(acetonitrile)B(%B)：二元流动相中的强溶剂(％v/v)C8,C18:烷基键合相的键长度(八烷基或十八烷基)CD：环糊精(cyclodextrin)CV：变异系数(通常以％表示)；式15.3dC：色谱柱内径(cm)dP：颗粒直径(um)DAD：二极管阵列检测器EC：电化学(检测器)F：流速(ml/min)FL：荧光(检测器)GS：梯度斜度参数(式8.2a)；k*=20/GSh'：峰咼HPLC：高效液相色谱ID：内径，dCIEC：离子交换色谱(ion-exchangechromatography)IPC:离子对色谱(ion-pairechromatography)k：保留因子(式2.4)k*:梯度洗脱中,k的有效值或平均值(式8.1)ka,kZ：色谱图中，首峰(a)和末峰(z)的k值L：色谱柱长度(cm)LC-MS:液相色谱-质谱M：分子量MC：二氯甲烷(methylenechloride)MeOH:甲醇(methanol)MS:质谱MTBE:甲基-叔-丁醚(methyl-t-butylether)N：色谱柱塔板数(式2.82.8b)N'：噪音(式3.3,图3.3)NARP:非水反相HPLCNPC：正相色谱P：色谱柱压力降(通常以psi表示)(式2.9)pKa:酸或供质子碱的酸性常数PAH：多环芳烃(polyaromatichydrocarbon)RS：分离度(式2.1)RI：折光指数RPC：反相色谱S：信号;式3.3;图3.3;以及由式6.1定义的参数tD：延迟或滞留时间(min，用于梯度洗脱中);等于VD/FtG：梯度时间(min)tR：保留时间(min)(图2.2);等于tO(1+k)tRa,tRz:色谱图中首峰(a)与末峰(z)的保留时间，tR(min)(图8.6a)tO：色谱柱死时间(min)(式2.5)tl,t2:相邻谱峰1与谱峰2的保留时间(min)TEA:三乙胺(triethylamine)THF:四氢咲喃(tetrahydrofuran)UV：紫外光谱VD：延迟或滞留体积(mL);为梯度混合器与色谱柱人口之间的体积(包括混合器的体积)Vm：色谱柱死体积(mL)(式2.6);Vm为色谱柱内部的流动相体积，不包括附于固定相上的溶剂Vmax:最大样品体积(mL)(式13.1)Va：样品体积(mL)w：重量(mg);也作半峰高处的峰宽(min)wmax:不超载色谱柱的最大进样量(mg)(式2.17)wS：色谱柱的饱和容量(mg)(式13.4)W：峰底宽(min)(图2.2)Wth:大进样量对峰底宽的贡献(min)(式13.2)WO：小进样量的峰底宽(min)W1/2:半峰高处的峰宽(min)(图1.1)a：分离因子，等于k2/k1,其中k2与k1分别为相邻谱峰2和谱峰1的k值△tR：tRz-tR(min)△%B：梯度洗脱期间,％B的变化£:摩尔吸收系数£0：正相HPLC中溶剂或溶剂混合液的强度n粘度(CP)<<不常有符号>>A,B,C：式2.11中的常数;数值A,B与C随k值而变化,但改变其它条件或溶质时基本不变A',B',C':式2.10中的常数;数值A',B'与C'随条件和样品而变化A”,B”,C”：式2.10a中的常数;数值A”,B'与C”随条件和样品而变化C：谱峰最大值处的浓度(mol/L)CO：注入样品中溶质的浓度(mol/L)GI：化学电离(MS)DGA：N,N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)EI：电子电离(MS)ELS:蒸发光散射击(Evaporativelightscattering)EtOAc:乙酸乙酯(ethylacetate)FAB：快速原子轰击(MS)FD：场解吸附(MS)h：折合板高，等于H/dP(式2.11)HB：羟基苯甲酸(hydrxybenzoicacid)(图7.8,7.17与7.19)HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyricacid)IPA：异丙醇(isopropanol)kW：以水作为流动相的k值(式6.1)LCEC:液相色谱电化学检测器LD：激光解吸(MS)LSIMS:液态二级离子质谱MALDI：基质辅助激光解吸电离MP：对羟苯甲酸甲酯[P-]m:流动相中离子对试剂P-的浓度(mmol/L)PAD：脉冲电流分析检测器PBP：极性键合相PD：等离子解吸(MS)PP：对羟苯甲酸丙酯PTH：乙内酰苯硫脲R+,R-:分别为阴离子与阳离子离子交换色谱柱中的荷电功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]RF：响应因子TBA+:四丁基铵离子tBME：见MTBETMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也为C1)TNB：1,3,5-三硝基苯(1,3,5-trinitrobenzene)TOFMS：时间飞行质谱TSP：热喷雾(MS)u：流动相通过色谱柱的速度(cm/s);等于L/toV：峰底宽(mL)Vc：色谱柱内峰展宽对V的贡献;也作小样品量峰底宽(mL)(式2.16)VR：保留体积(mL)W：峰宽(min)(式2.12)Wc，WS,：分别为色谱柱，进样器，连续管和流通池对W的贡献(min)Wlc,Wfc：（式2.12）X,X1,：无特征结构的溶质（图7.8,7.17和7.19）X2,X3XB：流动相中的B溶剂的摩尔分数V：折合速度，等于udp/Dm（式2.11）6：高斯曲线的标准偏差;等于峰底的1/4I：检测器响应时间常数（S）申：流动相中B溶剂的体积分数;等于0.0制备色谱技术与操作及实验经验制备色谱到底是什么？（1） 分析色谱的目的,是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的,是从混合物中得到纯物质。为了加快分离的时间与提高分离的效率,制备色谱的的进样品量很大,导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大,也就必须加大色谱柱填料,增大制备色谱的直径和长度,使用的相对多的流动相。然而,当色谱柱上样品负载加大的时候,往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱,要解决容量与柱子效果之间的矛盾,对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料,少用溶剂,要尽可能多的得到产品。（2） 样品的前处理：制备色谱柱子由于处理的样品多,比分析柱子更容易受污染,所以,必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法,如果用得上,而且还不是很麻烦,就要尽可能多的采用以去掉杂质。（3） 制备色谱柱的材质及其特点下面介绍一下,制备色谱柱常用的材质及其特点。各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到,而且价格低廉,但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小,且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候,高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空,也能在一定程度上解决这个问题。不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能,但其价格相对很贵。如果,只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀,相对不锈钢柱子而言,它是半透明的,可以看到液体的运行状态,对有色的物质其特点就更为突出。（4） 固定相的选择硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂、聚酰胺、氧化铝、凝胶等都可以作为色谱柱的填料。有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理。（5） 装柱方法的选择根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于20－30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击一装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为30—40bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱,可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种：径向压缩和轴向压缩。湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。（6） 流动相的选择除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。（7） 加样的方法可以采用以下方法之一进样。—用注射器进样—用旋转阀进样—通过六通阀进样—通过主泵进样—通过辅泵进样—固体上样（8） 泵的选用生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。（9）检测器的选用一般的分析池的最大允许流速仅为 5mL/min或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。（10） 组分保留时间的估计用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。（11） 产品的收集手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。（12） 超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系，不在这里叙述。（13） 柱转换技术通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个（或几个）组分的精制。（14） 比较新的制备色谱技术模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用。问:我想购买waters600用于分析和制备，对于其配备有什么好的建议。答：[vihig][davvy]可以配一个PDA,另外加一个示差折光410,另外买几根制备柱就可以了。waters600的流速最大为20mL/min，一般可以配20mmID的制备柱，一次分离10-100mg的样品，如果样品量更大，可以通过配件扩展到45mL/min，使用30mmID的制备柱。另外为了保证馏分收集的准确性，最好配上FractionII馏分收集器。如果样品数量很大，可以配2767samplemanager和ZQMS,同时做自动进样并通过MS或UV信号自动收集馏分。这样可以过夜自动运行。最大通量每天可以处理100-200个样品。问：如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？制备色谱柱为ZorbaxSB-C189.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如流量，进样量，样品的浓度，切割点的设置，是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。（主峰后有二个杂质靠得很近。)答：[vihig][davvy][云帆]1制备用的流动相最好等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。2使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算精确，检测器的响应时间设到最小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为ImL/min,9.4mm制备柱用1*(9.4/4.6)2,大约为4ml/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5ug,显然浓度太低，最好是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。问：我想用hplc分离一个简单的多肽,我应该选用什么样的流动相,还有他的梯度,还有选用什么样的柱子答：[yingmw][zyh]RP-HPLC,C18柱可以制备很少量的肽。如果用RP-HPLC,首先应该用同类型的分析柱子分析一下多肽含多少杂质，设置缓缓的梯度的分离样品，在根据分析柱子跑出的峰形，逐渐放大纯化的方法。4问：TFA在缓冲液中是不是只起到调节pH的作用呢？TFA的浓度越高基线的漂移越厉害，那是不是说它的浓度在缓冲液pH允许的情况下越低越好呢？答：[zyh][skywalker]TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。问：样品如果溶解度太低如何上制备HPLC？答：[aaron][云帆][skywalker][natura]了解一下样品的性质，根据其酸碱性，极性等性质，通过调节溶剂的pH值等，以达到较好的溶解度样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂(如丙酮等)以助溶。不是一定要用流动相来溶解样品，对溶解度差的样品，可以选择甲醇，THF或DMSO等溶解样品。特别是DMSO,对一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不会造成干扰。而且DMSO的洗脱能力很弱，一般不会影响峰型。可以固体上样。问：多肽的分离制备,如何上量？如何增大分离度?答：[xia][888wym]反相HPLC应当是很好的分离小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O(95：5)做流动相，看保留如何，若无保留，建议改用其他色谱方法进行分离。关于多肽的分离，首先要知道它的分子量大小，然后选择不同类型的填料，如孔径的大小。我们先在分析柱(4.6MM内径)上做一下实验，找到最大的分离度，这一过程的难度是最大的，要不断地改变流动相和固定相,然后再线性或非线性放大到制备,放大的倍数按分析柱的实验结果。分离后可以通过冷冻干燥得到固体。还可以考虑离子交换来分l离7问：做柱层析时(国产大孔吸附树脂)，怎么才能把洗脱液中的树脂残留物处理干净？答：[supu][richies][郭峰]大孔吸附树脂在上使用前，一般需要进行处理，方法包括用色谱纯的甲醇或乙睛洗到没有吸收；或树脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常规的酸，碱洗。再用丙酮回流二小时就可以用了。问：由分析型液相转为制备型液相，其色谱系统需作多大调整？是否可以按照柱体积折算只改变流速？其上样量多大为宜？答：[zqingyi][clitonzhou]泵要换，流量要加大，压力可不变或减少；流通池要换体积更大的。（2）整个系统的管路要更换更粗的，否则压力太大,而且特别容易发生堵塞。对流通池后的管路，最好增加反压调节器，否则管路太短的话，反压小会导致流通池气泡，管路长的话会导致峰展宽。（3）检测器的响应时间和峰宽要设置合适，否则会导致收集时延迟体积的计算不准（4）上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料）；一般上样量与柱子直径的平方以及长度成正比。问：流动相中含有盐时，收集液该如何除盐？选用挥发性酸，碱或盐（如醋酸铵）是否会在挥干溶剂或冻干过程中直接除去？答：[半透膜][zqingyi]一般可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。但也是稍微麻烦的事情，最好，不加加酸碱盐，如果要加的话最好，要加挥发性的或者对产品或者检测没有干扰的。可用G25脱盐，它是安马西亚出的一种葡聚糖凝胶。交联度大孔径小,对小分子的无机盐保留较大,而对分子量较大的有机物没有保留从而可以将盐份脱除。另外采用挥发性的酸，碱时，一般会在干燥过程中直接除去，但如果样品也有酸碱性，可能会与这些挥发性酸碱形成一定比例的盐。问：制备型柱子柱压上升柱效下降怎么办？答：[songlankun][yaozhaobing][hqwd][wu_pass]对高价值的制备柱来讲，延长柱子寿命是很重要的。一般要注意保护柱子，一般来说，制备柱子一般需要保护柱配套。下面是可能堵塞柱子的原因（1） 如果您所分离的样品中杂质较多而您在上样前没有经过过滤（0.45微米），一些颗粒性杂质会积聚在柱头造成柱压升高，（2） 也有可能是因为您所使用的流动向中含有缓冲盐的原因，结晶或发生化学变化而堵塞。可以把柱子冲一冲。（3） 流动相是否符合液相色谱的要求？是否过滤处理？。柱子再生处理办法如下：（1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。（2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。（3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污染柱子）问：制备柱柱跑干了影响柱效吗?答：[胖丁丁][enzyme110][闲云]如果时间不长的话,可以用流动相多冲几个小时.柱效不一定变化很大.如果时间太久,柱效一定变低.具体造成影响有多大，要靠柱效测定来确定，而不是干柱时间的长短。如果跑干了，对于PUMP的影响可能还大些，所以最好先把管路中的空气抽走再说。一般说来，制备柱子跑干，属于操作失当。柱子闲置不用时，最好冲入甲醇或其他有机溶剂，一定要把两头堵住密封，这样保留的时间会较长。12问：分析HPLC如何放大到制备型HPLC答：[clitonzhou][frankgao]在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，但这种方法从经济上一般不合适。在制备液相中，最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称，分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提高效率）。一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本，所以，可以加大上样量，甚至过载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高设备利用率。13问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用吗？答：[sya][zwc][haode0864][jianjun_he]流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量，计算后再使用。要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲，实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。14问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？答：[jianjun_he]TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除，国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好，还可以起到浓缩样品的作用。首先，冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈，药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是最最简单、有效的。其次，如果你的药物的分装量不大的话（＜100ug），建议你用离子交换层析，最好装一个小