(29)-3.4.1凝胶层析的基本原理

凝胶层析第一节凝胶层析的基本原理同学们好，本章我们将对凝胶层析的原理、操作及应用进行学习。凝胶层析，又称为分子筛层析，排阻层析，凝胶扩散层析等，是一种将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，借助于各组份流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的，简便有效的层析方法。如图所示，当具有一定分子量分布的高聚物溶液从装有多孔物质填料的凝胶层析柱中通过时，由于分子会以不同程度向填料内孔中扩散，所以较小的分子在柱中停留的时间比大分子停留的时间要长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。凝胶层析的分离原理主要包含三个理论，分别为平衡排除理论，扩散分离理论和流动分离理论。平衡排除理论中所提到的平衡是指扩散的平衡，即溶质分子扩散进入一个填料颗粒的孔中，然后流出所需的时间远小于溶质区段在此停留的时间。也就是说，当溶质曾流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出填料的孔，达到平衡。平衡条件是在流速很慢时的一个极端情况。而扩散分离理论的一个基本出发点就是认为，溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，因此，势必存在着流速依赖性。图中所示为两种不同流速下的苯乙烯和聚苯乙烯的淋出曲线。苯乙烯分子小，扩散速度快，容易在两相间达到平衡，所以，淋出曲线是一个很窄的，近似高斯分布的峰，并不太受流速的影响。与之相反，聚苯乙烯分子大，扩散系数小，难以渗入凝胶，所以比苯乙烯提前淋出。由于扩散速度小，在较高流速下，两相之间难以建立平衡，因此淋出曲线变得又宽又斜，因为不平衡的程度受流速影响，所以，淋出曲线呈现出流速依赖性。学习流动分离理论前，我们先来看一个有趣的现象，红细胞在毛细血管中流动时，比血浆流的快，这是由于红细胞较大，和毛细管的半径同数量级，所以在流动时被集中到管子的中心区域，在这里液体的流速比靠近管壁的流速要大，如果红细胞的存在对于流线的扰动不太强烈，则他们的平均速度大于血浆的速度。如果一个毛细管中心所处的流线，和管壁之间距离为a，溶质分子半径为R，当a大于R时，分子可以落入管中，当a小于R，则不能落入。所以，当溶质分子通过多孔填料时，排除效应使得较大的溶质分子不能进入，而液体在填料外面的流速大于填料内的流速，对于那些能够落入填料中的较大的分子，又由于流速场集中到填料内孔的中心部分，而加快了速度，最终使得溶质按照尺寸的不同被分开了。而流动分离理论主要是指较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。（图）三种理论在凝胶层析过程中是共存的，不是相互排斥的，主要看哪一种机制在分离过程中占主导地位。平衡排除理论在分离过程中起主要作用，但随着流速的增加，扩散分离理论的重要性也随之增加，当流速很高时，主要起作用的则是流动分离机制。下面我们从定量角度详细分析一下凝胶层析过程，首先，三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离，洗脱后收集洗脱液，并测定浓度，以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标，可得洗脱曲线（图）我们规定，Vt为整个柱床的体积，Vg为填料骨架体积，V0为凝胶柱床中凝胶颗粒之间的体积，称作空隙体积或外水体积，Vi为柱中凝胶颗粒内部所含的液相体积，称作内水体积，Ve为流经体积，则有可以看到，最先流出物质A，A分子量最大，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间。“部分排阻”或“部分渗入”。流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi这里的Kd称作排阻系数，或分配系数。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度，对于一定种类的凝胶，物质的Kd值为特征常数。当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入当某些物质分子与凝胶存在吸附作用时，Kd的值可能大于1，而当某些小分子物质形成水合物时，Kd值也会小于1.由于Vg和Vi难以测算，且Vg相对于Ve数值较小，造成偏差较小，所以有人对Vi和Vg不加细算，将整个凝胶作为固定相来看，采用有效分配系数Kav来代替Kd。了解了凝胶层析的基本原理，下面我们来看一下这种分离方法的特点：1凝胶层析操作简便所需设备简单，一根层析柱即可进行工作分离介质并且可重复使用；2分离效果好，重复性高，样品回收率和可接近100%；3分离条件缓和，凝胶骨架清水分离过程不涉及化学键的变化，对分离物活性没有不良影响；4应用广泛适用于各种生化物质的分离纯化，脱盐，浓缩以及分析测定等，且分离的分子量范围很宽；5由于凝胶层析是以物质分子量的不同，作为分离依据的，因此分离操作必须控制流速，分离过程时间较长。对于分子量相差不大的物质，难以达到较好的分离效果，分辨率不高。凝胶作为凝胶层析中的关键部分，接下来我们来了解一下凝胶的种类，凝胶层析中常用的凝胶主要包括葡聚糖凝胶、修饰葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖类凝胶、多孔玻璃微球、疏水性凝胶六大类，它们都是通过胶体粒子或高分子在一定条件下互相交联，形成具有空间网状结构的一种特殊的分散体系。不同的凝胶具有不同的规格型号，间接反映了凝胶的吸液量、溶涨时间、凝胶孔