淋巴细胞转化实验

淋巴细胞转化实验第1页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞培养概述细胞培养（cellculture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。第2页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞培养实验的基本要求实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。第3页，共30页，2023年，2月20日，星期一实验中要求：

Ω一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。

Ω试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。

Ω专管专用。Ω手不要从敞开的瓶口上方经过。Ω换液时，吸取培养基的吸管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞;

Ω细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养第4页，共30页，2023年，2月20日，星期一实验后要求：关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。第5页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞培养条件合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。常用青、链霉素；庆大霉素等。消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH调整液

NaHCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4%Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用培养条件：无菌、３７℃、５％ＣＯ２第6页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞培养基本技术细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养。√悬浮生长细胞传代：离心法√半悬浮生长细胞传代：直接吹打法√贴壁生长细胞传代：胰酶消化法第7页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存

10％DMSO（低温保护剂），20％以上的血清，其余为培养基，细胞数1×106个-1×107个。二步冻结法。细胞的复苏

从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37℃水浴中充分摇动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养。细胞的运输

长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。第8页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞培养常见污染及处理方法细菌污染处理:将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或5mol/LNaOH;重要克隆洗涤数次后,大剂量联用抗生素效果较好;反复洗涤后注射到小鼠腹腔中(限用于某些细胞)培养液变混浊，pH改变;细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。第9页，共30页，2023年，2月20日，星期一处理:应用达克宁、咪唑康；处理CO2孵箱真菌污染培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，培养液一般不发生混浊；镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间，有的呈链状排列;细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。第10页，共30页，2023年，2月20日，星期一支原体污染难发现,难去除;预防为主新一代支原体抗生素可杀灭支原体一般过滤除菌无法去除，光镜下难以看清形态结构;能在偏碱条件下生存;对青霉素有抗药性;多吸附于细胞表面或散在于细胞之间;多数细胞污染后无明显变化如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染第11页，共30页，2023年，2月20日，星期一扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体第12页，共30页，2023年，2月20日，星期一处理:

更换血清;增加细胞的接种密度，以提高细胞的生存率黑胶虫污染可以穿过滤膜.低倍镜下为黑色点状,高倍镜下可见黑点游动;培养液一般不受影响;细胞增殖旺盛时可自然消失第13页，共30页，2023年，2月20日，星期一淋巴细胞转化实验2010.12.21第14页，共30页，2023年，2月20日，星期一淋巴细胞在体外培养时，受到刺激剂的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。原理第15页，共30页，2023年，2月20日，星期一T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；第16页，共30页，2023年，2月20日，星期一作用于人和小鼠T/B淋巴细胞的重要丝裂原对T/B淋巴细胞的粗增殖作用人T细胞人B细胞小鼠T细胞小鼠B细胞刀豆蛋白A（ConAn）+_+_植物血凝素（PHA）+_+_美洲商陆（PWM）++++脂多糖（LPS）___+葡萄球菌A蛋白菌体（SAC）___+第17页，共30页，2023年，2月20日，星期一分离人外周血单个核细胞（PBMC）分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术)淋巴细胞转化试验实验流程第18页，共30页，2023年，2月20日，星期一实验流程

－－PBMC的分离基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。第19页，共30页，2023年，2月20日，星期一←ＰＢＭＣ←淋巴细胞分离液←红细胞、粒细胞、血小板←血浆第20页，共30页，2023年，2月20日，星期一实验流程

－－淋巴细胞转化实验基本原理：在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。第21页，共30页，2023年，2月20日，星期一形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。

（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。（二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。实验流程

－－结果观察第22页，共30页，2023年，2月20日，星期一（四）3H-TdR掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。

实验流程

－－结果观察第23页，共30页，2023年，2月20日，星期一第24页，共30页，2023年，2月20日，星期一取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）（共6ml）将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1）（滴管2）.离心之前计数细胞弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml.将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照.

B组：加入100ulConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.实验步骤第25页，共30页，2023年，2月20日，星期一A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值.

B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测第26页，共30页，2023年，2月20日，星期一细胞数/ml＝4大格中细胞总数4×104

×稀释倍数第27页，共30页，2023年，2月20日，星期一ConA的倍比稀释10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450µL440µL220µL220µLOriginalsampletubetube1tube2220µLConA20ug/ml250ul