新一代测序技术的原理

新一代测序技术的原理第1页/共60页Agenda

测序技术简史第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术第2页/共60页1测序技术简史

1950196019701980199020002010DevelopmentofSangerSequencing(1977)InventionofAutomatedFluorescentSequencer(1985)InventionofCapillarySequencer(1996)InventionofAppliedBiosystemsSolidSystem(2007)InventionofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Inventionof454GS20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)InventionofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemoleculerealtime(SMRT)DNAsequencingInventionofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)InventionofpersonalgenomemachineInventionofopticalmapping

system第3页/共60页

1977年，英国人FredSanger发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。第4页/共60页5´磷酸3´羟基3´,5´-磷酸二酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图核酸序列形成的基础第5页/共60页“双脱氧末端终止”的含义第6页/共60页TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标记方法因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。第7页/共60页第8页/共60页第9页/共60页3730xlSequenceMap第10页/共60页200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms第11页/共60页454测序原理测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。

如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺入的核苷酸数目成正比。反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。第12页/共60页454测序流程第13页/共60页待测DNA文库的构建将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉，片段AB\BA\BB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。第14页/共60页Emulsion

PCR将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28μm的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增,扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。第15页/共60页测序将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进行测序。PTP板上含有很多直径约为44μm的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下的测序反应。第16页/共60页454的特点较高的测序通量，每个循环能产生总量为400-600Mb的序列。提高测序读长，长度达到400bp，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。因此454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。第17页/共60页200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms第18页/共60页第19页/共60页n=degeneratebasesz=universalbases第20页/共60页第21页/共60页第22页/共60页第23页/共60页第24页/共60页第25页/共60页第26页/共60页第27页/共60页第28页/共60页第29页/共60页SOLiD的特点通量大成本低序列短Ligase的方式虽然能一定程度避免phasing/pre-phasing，但增加的复杂度也降低了效率灵活性差，对小数据量测序不适用Two-basecoding第30页/共60页200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms第31页/共60页2Hiseq2000（Solexa）测序原理

Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(FlowCell)上进行桥式PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。第32页/共60页

可逆阻断技术第33页/共60页CTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一个碱基Cycle1:按顺序加入反应试剂

清除未反应的碱基和试剂

激发碱基荧光并收集荧光信号

去除阻断基团和荧光基团Cycle2-n: 重复前面的步骤GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS的Solexa测序技术第34页/共60页3Hiseq2000测序技术流程制备芯片模板杂交桥式PCR扩增测序引物准备测序2测序测序

生成basecalls3数据分析拍照图片IntensitiesReadsAlignments4DNA打断末端修复加A加接头纯化文库制备1第35页/共60页3.1文库制备

Solexa有三种不同的测序种类：Single-ReadSequencing

单向测序Paired-EndSequencing

双向测序IndexedSequencing

混合样品测序这三种测序类型的文库构建大体一致，主要区别在于接头。第36页/共60页Single-ReadSequencingFragmentDNA5’3’5’+3’5’5’+5’3’3’5’1.Endrepair

T4polymerase,DNAPol1(Klenowfragment)3’5’po4po45’3’PhosphorylationT4polynucleaotidekinase,ATP3.Ligationofadaptors3’Apo45’A3’5’po42.Add3’AdenosinewithKlenow(3’exo-)anddATP+DNAinsert5’5’3’3’SBSoligoP7反向互补序列3’T5’po43’5’SBSoligoP7反向互补序列第37页/共60页PCRenrichment5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’3’3’1stroundPCRP7P5SBSoligoP7反向互补序列P73’第38页/共60页PCRenrichment(cont.)5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’2ndroundPCRInsertP7P5SBSoligoP7反向互补序列P5ClustertemplateSBSoligoP7第39页/共60页Paired-EndSequencing

双向测序IndexedSequencing

混合样品测序第40页/共60页第41页/共60页3.2芯片制备和测序Cluster生成步骤:固定扩增线性化

阻断引物杂交Cluster生成化学步骤cBOT第42页/共60页FlowCell想像图进样孔出样孔第43页/共60页Single-ReadSequencing(SR,单向测序)OHFlowCell接头diol

P7

P5

dioldiol模板杂交dioldiol

延长dioldiol

变性碱基片段杂交固定第44页/共60页

dioldiol1stcycle

变性1stcycle

退火dioldiol1stcycle

延长dioldioldioldiol2ndcycle

变性2ndcycle

退火dioldioldioldioldioldiol2ndcycle

延长n=35总数碱基片段扩增成簇第45页/共60页线性化OH用ddNTP()阻断Cluster扩增完成OHdioldiolOHClusterStation结束Primer加测序引物OHNaIO4第46页/共60页每一个基因簇就是信号收集照片上一个亮点第47页/共60页YX通过荧光信号读取序列信息第48页/共60页123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…通过荧光信号读取序列信息第49页/共60页3.3测序Paired-EndSequencing(PE,双向测序)和IndexedSequencingSR与PE的FlowCell接头对比SingleReadPairedEnd第50页/共60页TemplateHybridization模板杂交UUOHOHGraftedflowcell芯片上的接头U

P7

P5

DNA片段杂交和固定Initialextension第一链的延长UUDenaturation变性UU第51页/共60页 1stcycledenaturation变性n=25total碱基片段扩增成簇UU1stcycleannealing退火UU1stcycleextension延长UU2ndcycledenaturation再变性UU2ndcycleannealing退火UUU2ndcycleextension延长UUU第52页/共