三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变实验

三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变试验

一、实验目的1、掌握Ames试验的基本原理及应用2、了解Ames试验的基本步骤3、通过该实验，了解三氯乙烯的致突变作用二、实验原理原理：是一种利用微生物进行基因突变的体外致突变试验方法。基本原理是利用同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

鼠伤寒沙门氏菌野生型（his＋）

鼠伤寒沙门氏菌突变型（his－）

正向突变回复突变受试物试验菌种(his-)S9试验菌种(his-)S9Ames试验原理三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)是一种常用的有机溶剂，主要用作金属的脱脂剂和脂肪、油、石蜡等的萃取剂，也用于干洗毛织品和衣服。近年来，三氯乙烯职业性中毒时有发生。为了解三氯乙烯的致突变作用，开展了三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的回复突变试验。三.实验材料标准试验菌株(配套菌株)：有四种

TA98、TA97：检测移码突变

TA100：检测碱基置换突变

TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏性S9液三氯乙烯辅酶-Ⅱ6-磷酸葡萄糖单钠盐二甲基亚砜(DMSO)四.实验步骤1.菌株鉴定用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。2.斑点实验3.平板掺入实验4.两法比较1.菌株鉴定（1）组氨酸缺陷型的鉴定

（3）

紫外线损伤修复缺陷型的鉴定（2）

脂多糖屏障缺陷的鉴定

（5）

自发回变率的测定

（4）

R因子和四环素抗性的鉴定

(1).组氨酸缺陷型的鉴定

组氨酸缺陷型的鉴定加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸)，不加组氨酸者每100mL底层培养基中加0.5mg分子D－生物素0.6mL；加组氨酸者每100mL底层培养基中加L－组氨酸(每100mL中含0.4043g)1mL和0.5mg分子D－生物素0.6mL，冷却至50℃左右，各倒两个平皿。接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线)接种在培养基表面，37℃培养48h。结果：四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。(2).脂多糖屏障缺陷的鉴定

加热融化营养肉汤琼脂培养基。接种：取菌液0.1mL移入平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷却至50℃左右)适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)10μL，37℃培养24h，每个菌做一个平皿。结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa(深粗型)突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。

(3).紫外修复缺陷型的鉴定

在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。接种后的平皿一半用黑纸覆盖，另一半在距15W紫外线灭菌灯33Cm处照射8s，37℃培养24h。结果：对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TA100)仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。(4)自发回变率的测定

准备底层培养基平皿8个.融化顶层培养基8管，每管2mL，在45℃水浴中保温。在每管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL，一式二份，轻轻摇匀，迅速将此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃培养48h计数菌落数。结果：每一株的自发回变率应落在正常范围内。2．斑点试验

吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊子夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。3．平板掺入试验

将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4～5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。4.两法比较斑点实验平板掺入实验定量测试样品致突变性的强弱

较斑点实验敏感，获阳性结果所需的剂量较低限于能在琼脂上扩散的化学物质

敏感性较差

定性实验

四.实验结果TA102组别剂量(mg/皿)TA97-(S9)+(S9)TA98-(S9)+(S9)TA100-(S9)+(S9)-(S9)+(S9)受试物自发回变溶剂对照阳性物对照五.讨论

菌株TA100的菌落数均比空白对照菌落数增加一倍以上，且随三氯乙烯剂量的增加，TA100的菌落数也相应增加三氯乙烯能导致菌株TA100的突变(碱基对置换)，说明三氯乙烯是一种致突变剂。

S9存在的情况下导致鼠伤寒沙门氏菌菌株TA100数量增加的数量比S9不存在情况下多.三氯乙烯的致突变作用可能部分是由于三氯乙烯经过代谢成中间活性产物而起作用。

不论是否加S9，菌株TA97、TA98、TA102的菌落数不但未能比空白对照组的菌落数增加1倍以上，反而比空白对照组的菌落数少可能与三氯乙烯具有杀菌作用有关，同时也说明三氯乙烯在本实验所设计的剂量的条件下，未能引起移码型突变。材料和方法结果讨论三氯乙烯是能导致菌株TA100发生突变的致突变剂(碱基对置换)。三氯乙烯的致突变作用可能部分是由于三氯乙烯经过代谢成中间活性产物而起作用。结论六、作业自主设计一个试验，利用Ames试验方法检测某种物质的致突变性。可查阅相关文献。试验报告

试验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂；（2）试验菌株：所用试验菌株；（3）代谢活化系统：所用诱导剂；（4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准；（5）结果：以列表方式报告受试物的Ames实验结果（表1）；（6）结论。证明Ames试验重要性的应用实例：

国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。Ames实验室无菌操作

吸入染毒试验装置（液气）吸入染毒试验装置（粉尘)

）动物饲养装置

鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验（Ames实验）目的:为了研究复方生物黄酮（圣安泰牌百力康片）的潜在致突变性。方法我们对该产品进行了Ames实验结果:为阴性，均未见毒性改变。结论:复方生物黄酮在服用剂量内未见致突变性。1材料与方法

1.1样品复方生物黄酮的商品名称为圣安泰牌百力康片，由哈尔滨圣安泰生物科技有限公司提供。样品以枸杞、黄芪、银杏叶为主要原料，辅以其他辅料制成，功效成分为总黄酮。

1.2材料昆明种小白鼠（批准证号：医动字第09-2-7号），购自黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心。TA97a、TA98、TA100和TA102四种菌株引自美国加州大学Ames实验室。

1.3方法

TA97a、TA98、TA100和TA102四种菌株引自美国加州大学Ames实验室。经菌株特性鉴定均符合实验要求。活化系统为PCB-五氯诱导的雄性Wistar大鼠肝s-9液。按1：9加入辅助因子（Ames

1983年配方）配成10％s-9混合液，经阳性诱变剂活性鉴定符合实验要求。实验样品经XAD-11树脂柱过滤及洗脱预处理，最后以DMSO为溶剂，剂量设计分别为5mg/皿、1mg/皿、0.2mg/皿、0.04mg/皿和0.008mg/皿受试物。除上述5个剂量组外，又设未处理对照组、溶剂对照组（DMSO）和阳性对照组［加s-9用2-AF（TA102用1，8-二羟蒽醌），不加s-9用DEXON（TA100用叠氮钠）］。采用平板渗入法进行实验。在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液0.1ml，混匀；加受试物或对照物0.1ml［需活化时加入10％s-9混合液0.5ml（含s-9

5μl）］，论文联盟整理再混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃培养48h观察结果。每个剂量平行做了3皿，并重复一次，最后以3皿平均值报告实验结果.

2结果

表1圣安泰牌百力康片第一次Ames实验结果(x±s)

注：以上结果为3皿回变菌落数的平均值表2圣安泰牌百力康片第二次Ames实验结果（x±s）

注：以上结果为3皿回变菌落数的平均值

结论受检样品对Ames各实验菌株在加与不加活化系统条件下均呈阴性结果，即鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验为突变阴性结果。昆明种小白鼠，体重25～30g，共50只，在本实验室适应环境7天后，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。高剂量组剂量为10g/kgbw；中剂量组为5g/kgBw；低剂量组为2.5g/kgbw。阴性对照组经口灌胃蒸馏水；阳性对照组灌胃给予环磷酰胺，剂量为40.0mg/kgbw。按20ml/kgbw灌胃容积进行灌胃。采用30h给受试物法，即二次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，常规制片。显微镜双盲法阅片，每只小鼠观察1000个嗜多染红细胞（PCE），记录有微核的嗜多染红细胞数，计算出微核率。每只动物计数200个嗜多染红细胞，观察嗜多染红细胞与成熟红细胞比值。

1.3.2小鼠骨髓细胞微核实验