蛋白质的分离、纯化和表征

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白质的两性电离及等电点现在是1页\一共有47页\编辑于星期五二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液现在是2页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质现在是3页\一共有47页\编辑于星期五（二）蛋白质的沉淀

Pr从胶体溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解

——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等

现在是4页\一共有47页\编辑于星期五不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ现在是5页\一共有47页\编辑于星期五1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性现在是6页\一共有47页\编辑于星期五等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶现在是7页\一共有47页\编辑于星期五盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）现在是8页\一共有47页\编辑于星期五2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀现在是9页\一共有47页\编辑于星期五4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态现在是10页\一共有47页\编辑于星期五一.

分离纯化蛋白质的意义1.研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性；2.提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态；3.作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。二、蛋白质提纯的总目标：

增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。三、蛋白质分离纯化的一般原则现在是11页\一共有47页\编辑于星期五三、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶现在是12页\一共有47页\编辑于星期五2、根据溶解度分等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀3、根据电离性质分电泳离子交换层析1、根据分子大小分透析或超滤离心沉淀凝胶过滤层析4、特异亲和力：亲和层析沉降平衡离心法沉降速度离心法四、蛋白质的分离纯化方法现在是13页\一共有47页\编辑于星期五五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法

1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料现在是14页\一共有47页\编辑于星期五现在是15页\一共有47页\编辑于星期五血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液现在是16页\一共有47页\编辑于星期五凝胶过滤现在是17页\一共有47页\编辑于星期五凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大.测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex现在是18页\一共有47页\编辑于星期五（二）利用溶解度差别的纯化方法

1.等电点沉淀调整溶液pH

不同蛋白在各自pI处依次沉淀

2.盐溶和盐析现在是19页\一共有47页\编辑于星期五2.

盐析在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。现在是20页\一共有47页\编辑于星期五3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜现在是21页\一共有47页\编辑于星期五电泳原理蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。现在是22页\一共有47页\编辑于星期五电泳迁移率(泳动度)电场力F=q×E=q×U/d摩擦力Ff=f×VV/E=q/f蛋白质的泳动度反映了一种蛋白质的特性电泳迁移率(泳动度)m=V/E

现在是23页\一共有47页\编辑于星期五水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳现在是24页\一共有47页\编辑于星期五等电聚焦电泳现在是25页\一共有47页\编辑于星期五双向电泳蛋白质双向电泳现在是26页\一共有47页\编辑于星期五离子交换层析六离子交换层析现在是27页\一共有47页\编辑于星期五（七）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析疏水作用层析现在是28页\一共有47页\编辑于星期五利用选择性吸附的纯化方法1．羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。2．疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。

现在是29页\一共有47页\编辑于星期五（八）利用对配体的特异生物学

亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性现在是30页\一共有47页\编辑于星期五现在是31页\一共有47页\编辑于星期五六、蛋白质含量测定和纯度鉴定现在是32页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿之间

1道尔顿＝1×C12绝对质量/12≈1.66×10-27千克一、蛋白质分子的大小现在是33页\一共有47页\编辑于星期五（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量现在是34页\一共有47页\编辑于星期五（二）凝胶过滤法测定相对分子质量现在是35页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量现在是36页\一共有47页\编辑于星期五（三）SDS－PAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状现在是37页\一共有47页\编辑于星期五现在是38页\一共有47页\编辑于星期五十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键现在是39页\一共有47页\编辑于星期五现在是40页\一共有47页\编辑于星期五现在是41页\一共有47页\编辑于星期五现在是42页\一共有47页\编辑于星期五沉降速度法测定相对分子量直接测定蛋白质Mr的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法、黏度法。其中沉降速度法是经典的常用方法。沉降系数S见书P40蛋白质的沉降系数S与相对分子量Mr的关系斯维得贝格方程现在是43页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质的含量测定与纯度测定（一）蛋白质的含量测定1．双缩脲法双缩脲试剂：称取1.5gCuSO4·

5H2O和6g酒石酸钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加入300ml10%NaOH，稀释至1000ml。

3ml蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂，540nm比色。2．紫外吸收法

280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收，操作简便，但精确度不高。现在是44页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质含量测定Ⅱ3．Folin-酚法（Lowry法）蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定。

Folin-酚试剂的配制比较复杂。4．BCA法蛋白质还原Cu2

+成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。

现在是45页\一共有47页\编辑于星期五蛋白质含量测定Ⅲ5．染料结合法（Bradfold法）蛋白