实验四-RNA提取与其组分鉴定

学习从酵母中提取RNA和鉴定RNA组分的方法。一、实验目的第一页，共13页。二、原理：核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphate)核糖(ribose)嘌呤（嘧啶）碱Purine(pyrimidine)base核苷(nucleoside)

第二页，共13页。RNA(ribonucleicacid)背景知识

细胞RNA通常都是单链分子（但病毒RNA双链、环状、线型等多种形式），由核糖、碱基（A、U、G、C）和磷酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的RNA不断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白质合成的RNA有三类：转移RNA（transferRNA）、核糖体RNA（ribosomal）和信使RNA（messengerRNA）。研究表明，RNA不仅仅是遗传信息的中间传递体（fromDNAtoprotein）。RNA的功能总结起来可以分为以下几类：控制蛋白质的合成；作用于RNA转录后加工与修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细胞持家功能；遗传信息的加工与进化。第三页，共13页。

RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。酵母核酸中RNA含量较多RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的粗制品。RNA的分离第四页，共13页。RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸，可分别进行鉴定。组分鉴定

核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸核苷酸第五页，共13页。三、材料与试剂1、酵母2、0.04mol/L的NaOH溶液3、酸性乙醇溶液

0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中4、95％乙醇溶液5、乙醚6、1.5mol/L硫酸溶液7、浓氨水8、0.1mol/L硝酸银溶液9、三氯化铁浓盐酸溶液

2mL10％三氯化铁加入到400mL浓盐酸中10、苔黑酚乙醇溶液

6g苔黑酚溶于100mL95％乙醇（4℃保存）11、定磷试剂（１）17％的硫酸溶液（２）2.5％钼酸氨溶液（３）10％抗坏血酸溶液（４）蒸馏水使用时按下比例临时配置（体积比）：17％的硫酸溶液:2.5％钼酸氨溶液:10％抗坏血酸溶液:蒸馏水＝1:1:1:2第六页，共13页。四、实验步骤１、酵母RNA的提取：取酵母1.0g（3片）、0.04MNaOH+8ml研磨匀浆沸水浴20min离心10min（3000r/min）冷却至室温收集上清液于离心管

离心管中加入7mL酸性乙醇沉淀RNA离心3min（3000r/min）收集沉淀95%乙醇洗沉淀一次，无水乙醇洗沉淀一次离心3min（3000r/min）沉淀即为RNA粗品离心3min（3000r/min）第七页，共13页。2、RNA组分的鉴定RNA的水解：用10m1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。第八页，共13页。RNA组分的鉴定：（１）嘌呤碱

取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物的絮状沉淀。（２）核糖取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯化铁盐酸溶液，沸水浴10min，观察颜色变化（亮绿色）（３）磷酸取0.2ml水解液+0.8ml水+1ml定磷试剂，沸水浴10min，观察颜色变化（蓝色）第九页，共13页。五思考题

１、如何得到高产量的RNA粗品？２、本实验RNA组分是什么？怎样验证？第十页，共13页。无水乙醇洗沉淀一次离心3min（3000r/min）沉淀即为RNA粗品第十一页，共13页。用10ml1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。第十二页，共13页。（２）核糖取0.5ml水解液+0.2ml