核酸类药物生化制药技术

核酸类药物生化制药技术2023/4/111第1页，共24页，2023年，2月20日，星期五

概述

核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质,这类药物已广泛用于放射病(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。

反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存在的寡聚核苷酸片断（反义DNA和反义RNA），结合目标基因或mRNA特定序列(靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。2023/4/112第2页，共24页，2023年，2月20日，星期五

概述

核酸是由许多核苷酸以3’，5’-磷酸二酯键连接而成的大分子化合物。核苷酸由碱基、戊糖和磷酸三部分组成，碱基和戊糖组成的单元叫核苷。核酸类药物包括核酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生物。依据化学结构和组成分四大类：

1核酸碱基及其衍生物

2核苷及其衍生物

3核苷酸及其衍生物

4多核苷酸（C）（U）（T）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）β-D-核糖β-2-D-脱氧核糖2023/4/113第3页，共24页，2023年，2月20日，星期五核酸的生产方法酶解法～是先用糖质原料、亚硫酸纸浆废液或其他原料发酵生产酵母，再从酵母体中提取核糖核酸（RNA），提取出的核糖核酸经过青霉属或链霉属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。半合成法～即微生物发酵和化学合成并用的方法。例如由发酵法先制成5-氨基4-甲酰胺咪唑核苷（AICAR），再用化学合成制成鸟苷酸。又如用发酵法先制成肌苷，再利用微生物的或化学的磷酸化作用，使肌苷转变为肌苷酸。

2023/4/114第4页，共24页，2023年，2月20日，星期五2023/4/115第5页，共24页，2023年，2月20日，星期五

核苷酸的制备

核酸(RNA主要存在于微生物中，如啤酒酵母、纸浆酵母以及多种抗生素的菌丝体；DNA主要存在于动物内脏等)经酶、酸、碱水解生成核苷酸，然后分离提取制备各种核苷酸的方法通称水解核酸法。用催化剂的不同，分为酶水解、酸水解和碱水解等。

(1)酶水解最常用的酶有桔青霉A.S3.2788产生的5’—磷酸二酯酶，也可用红酵母发酵所产生的3’—磷酸二酯酶。2023/4/116第6页，共24页，2023年，2月20日，星期五

核苷酸的制备

（2）碱水解法在稀碱条件下，RNA容易水解得到2’—核苷酸和3’—核苷酸。实际上这是由于稀碱水解过程中，先形成一个中间环状物2’，3’环状核苷酸，它很不稳定，进一步水解生成2’和3’—核苷酸。稀碱水解的浓度随温度和作用时间的不同而异。用1M氢氧化钾或氢氧化纳在80℃下作用1h能使RNA水解成单核苷酸；用0.3M氢氧化钾或氢氧化纳在37℃下作用，要16h。2023/4/117第7页，共24页，2023年，2月20日，星期五从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸，如酵母、白地霉、多中抗菌素（青梅素、制霉菌素等）的菌丝体。通常在细菌中RNA占5～25%，在酵母中占2.7～15%，在霉菌中占0.7～28%。菌体内RNA含量的变化受培养组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于C、H比例和培养基组成等。RNA来源2023/4/118第8页，共24页，2023年，2月20日，星期五RNA的制备组织匀浆冷酸处理残留物酸溶性小分子有机溶剂处理脂溶性物质残留物酸处理碱处理酸提取液（RNA）残留物（DNA）上清液（RNA等）沉淀物（DNA，蛋白质等）2023/4/119第9页，共24页，2023年，2月20日，星期五实例2023/4/1110第10页，共24页，2023年，2月20日，星期五提取与纯化

乙醇沉淀法

提取去污剂沉淀法

酚法纯化：密度梯度离心法

柱色谱法

凝胶电泳法2023/4/1111第11页，共24页，2023年，2月20日，星期五RNA的含量测定RNA消化浓硫酸or过氯酸核苷酸、碱基、戊糖正磷酸+钼酸，H+磷钼酸还原剂钼蓝660nm处最大吸光度；分光光度法检测。DNA含磷量：9.4%RNA含磷量：9.9%2023/4/1112第12页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺

三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATP参与。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP)，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的调节作用。

ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞，且与体内需要的量比较，可能提供的量微不足道。2023/4/1113第13页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺

白色类白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂。在水中的溶解度具有氢型＞钠盐＞钡盐＞汞盐的顺序。在碱性溶液(pHl0)及低温下比较稳定。

ATP二钠是两性化合物。能与可溶性汞盐和钡盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性质可分离ATP。

1、化学结构和性质2023/4/1114第14页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺

（1）工艺路线

2、以兔肌肉为原料强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂

2023/4/1115第15页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺①兔肉松的制备②提取取肉松加入4倍量冷蒸馏水，搅拌提取30min，过滤后再提取1次。合并2次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。

2、以兔肌肉为原料③吸附取处理好的氯型离子交换树脂装入层析柱，用pH3的水将柱平衡。提取液上柱流速控制在0.6一1ml／(cm2.min)左右，吸附ATP。上柱过程中用DEAE—C薄板检查。

④洗脱饱和ATP柱，用pH3、0.03M氯化钠液洗涤柱上滞留的AMP、ADP及无机盐等，流速控制在1mL／(cm2.min)。再用pH3.8、1M氯化钠液洗脱ATP，流速控制在0.3ml/(cm2.min)，收集洗脱液。操作温度在0一10℃。2023/4/1116第16页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺⑤除热原、杂质将洗脱液按总体积计加入0.6％的硅藻土，0.4％的活性炭搅拌10min，用4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。⑥结晶、干燥用6M盐酸调滤液至pH2.5—3，在28℃的水浴中恒温,加乙醇，不断搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用无水乙醇、乙醚洗涤，收集ATP二钠结晶，置五氧化二磷干燥器内真空干燥，即得ATP成品。次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。

2、以兔肌肉为原料2023/4/1117第17页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺

3、产氨短杆菌直接发酵法2023/4/1118第18页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺①菌种培养培养基组成葡萄糖10％，硫酸镁1％，尿素0.3％，玉米浆适量，磷酸氢二钾1％，磷酸二氢钾1％pH7.2，接种量7—9％，pH控制在6.8—7.2。②发酵培养培养温度30℃，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨，控制pH。通风量1：0.5v／(v·min)。③提取、精制发酵液加热使酶失活后，调节pH3—3.5，过滤，分离除去菌体，上清液通过769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL-型阴离子交换树脂吸附ATP，经氯化钠—盐酸液洗脱．洗脱液经醇沉，过滤，丙酮洗涤，脱水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得ATP品。

3、产氨短杆菌直接发酵法2023/4/1119第19页，共24页，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生产工艺①应用兔肌肉为原料的提取法生产ATP，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以钡盐和汞盐纯化ATP。此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接危及操作人员身体健康。后改用蒸馏水提取ATP，树脂精制纯化从根本上解决了上述存在的问题．又可回收AMP、ADP，兔肉渣还可食用，总收率并不比汞盐法低。②产氨短杆菌B1是生物素缺陷型菌株，其诱变菌株也依赖生物素作为生长因子。玉米浆中含有丰富的生物素，加入培养基中使ATP的产量显著提高。4、注解

2023/4/1120第20页，共24页，2023年，2月20日，星期五第六节辅酶A辅酶A（coenzymeA，CoA）由-巯基乙胺、4-磷酸泛酸和3，5-二磷酸腺苷所组成，是ADP的衍生物或类似物，分子量为767.54.高纯度的CoA（95%）为白色无定形粉末，具有典型的硫醇味，有吸湿性，易溶于丙酮、乙醚和乙醇。CoA兼有核苷酸和硫醇的同性，与其他硫醇一样，易被空气、过氧化氢等氧化成无活性的二硫化合物，故制剂中宜加稳定剂（如半胱氨酸盐酸盐等），并最好充氮保存。CoA是乙酰基的载体，对酯类代谢、糖代谢、蛋白质代谢、甾醇的生物合成和乙酰化解毒等都起重要作用。2023/4/1121第21页，共24页，2023年，2月20日，星期五生产工艺[吸附]人造沸石[绞碎]心浆[提取]水，硫酸提取液[离心，碱化]氨水碱化液吸附细胞色素C的沸石流出液[酸化]稀硝酸酸化液[吸附，洗涤]活性炭，水pH4.0吸附CoA的活性炭[洗脱]水，40%含氨乙醇洗脱液[浓缩，酸化]硝酸pH2.5～3，35℃上清液沉淀物CoA丙酮干粉[干燥]4℃[透析]水，4℃，48h透析外液[制剂]水，甘露醇，L-半胱氨酸pH5.5～6，冻干冻干品新鲜猪心[沉淀]丙酮pH2.5～3，4℃2023/4/1122第22页，共24页，2023年，2月20日，星期五工艺过程1.酸化、吸附

沸石吸附细胞色素C后的流出液用稀硝酸调pH4.0，上活性炭柱，用蒸馏水洗株，在用40%乙醇洗至洗出液加10倍丙酮不出现白色浑浊为止。2.洗脱

用含3.2%氨的40%乙醇溶液洗脱，当流出液呈微黄色即开始收集，至pH10左右，停止收集。3.浓缩、酸化

洗脱液减压浓缩至原体积1/10（外温不超过60℃），用硝酸酸化至pH2.5～3.0，置冷库过夜。次日离心，上清液继续浓缩至原体积1/20左右。2023/4/1123第23页，共24页，2023年，2月20日，星期五4.沉淀、干燥

浓缩液用硝酸调节pH2.5～3.0，在剧