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文档简介

生药活性成分的高通量筛选技生药活性成分的高通量筛选技术生药活性成分的高通量筛选技术20世纪80机掌握、自动化操作、高灵敏度检测、数据结果自动采集和处日筛选量到达数万甚至数十万样品次,是药觉察技术和方法的一大进步。传统的药物筛选方法是承受药理学的试验方法,通过体由于传统的药理试验方法需要消耗大量样品,使用大量试验动物,参与试验的技术人员具有较娴熟的操作技能,而且筛高通量药物筛选是在传统的筛选技术根底上,应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化掌握等高技术,建立的一套更适合于药物筛选的技术体系。本文试对高通量筛选技术的根本原理及其在生药活性成分筛选中的应用做一简洁论述。根本原理高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的的技术体系,它以分子水平和细胞水平的试验方法为基础,以微板形式作为试验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集试验数据,以计算机对试验获得的数据进展分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。样筛选是一种利用已有的化合物进展的体外随机筛选。因此通过高通量药物筛选觉察先导化合物(leadingcompounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量。化合物样品的质量主要由化合物构造的多样性打算的。很多活性反响基团(reactivegroups)使初筛的假阳性大量增加,剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。化合物样品主要有人工合成和从自然产物中分别纯化两个来源。人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。承受常规化学合成的纯化合物始终是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过常年积存的化合物建立化合物样品库,通过购置和化合物沟通使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。组合化学(combinatorialchemistry)的消灭为大量增加化合物的数量供给另外一种来源。组合化学的根本原理是承受适当的化学方法,在特定的分子母核上参加不同的基团,在同样条件下,产生大量的化合物。这种方法在化合物的构造改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是,由于该方法是基于母核构造的改造,因此产生的大量化合物在构造多样性方面尚有极大的缺乏。解决组合化学产物构造多样性的问题,已经成为化学争论人员的争论课题。从自然产物中分别出来的化合物,母核构造和活性基团是长期的自然选择形成的,它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物觉察中具有人工合成化合物所不能比较的优势。因此,增加样品库中具构造多样性的自然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率,已经或正在寻求助买我国的天然产物单体。作枯燥、步骤单一,人工操作简洁疲乏、出错。自动化操作系统承受微孔板作为反响容器,具有固定的分布模式(format);不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进展操作,并将操作结果及相关数据存贮在计算机内,使筛选结果准确,试验过程快速。自动化操作系统利用计算机通过操作软件掌握整个试验过程。操作软件承受实物图像代表试验用具,简洁明白的图示代表机器的动作。编程过程简洁明白,可操作性强。自动化操作系统的工作力量取决于系统的组成都分,依据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进展相应的工作。除了试验步骤的需要以外,自动化的加样方式是打算筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于比照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开头、同时终止反响的筛选模型中是必需的。自动化操作系统的一个重要组成局部是堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反响板以及对它们进展转移所需的腾挪空间。因此,高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。由此可见,高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个局部组成。不同的单位可依据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的局部整合成为一个完整的操作系统。统化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高,即使对微量样品的检测,也可以得到很好的检测效果。液闪计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖试验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于承受了双光电倍增管准时间区分偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技术,有效地降低了背景信号的干扰,使测定灵敏度提高,同位素用量少。在96孔板的分析检测中,背景信号可10cpm左右。亲和闪耀分析(scintil1ationproximityassay,SPA)是一种的液闪分析法。该方法在细胞外表受体药物筛选中应用放射配体标记滤过分析技术由于需要进展分别,现已被亲合闪耀分析所取代。亲合闪耀分析技术通过亲合结合,将放射性配基结合到具有受体的闪耀球上,从而产生光子,削减了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分别过程,使得放射配基分析可完全以自动化的方式进展,适于进展高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进展放射性标记,而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸取,以确保只有结合到受体外表的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。分光光度法为了适应高通量药物筛选,很多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进展同时检测的分光光度计。以MolecularDevicespectra1908条光导纤维同时对82nm190nm850nm扫描以确定其特征吸取光谱。因此,大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出,可用随机软件或通用数据处理软件进展处理。便利、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接,使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。化学发光检测化学发光指生色物质在酶促作用下,化学能以光子的形式释放出来。化学发光依据发光的形式和种类分为辉光型和AMPPD、CDPS、ECLDiagoxigein等为根底的发光反响。其发光时间较长且稳定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反响则是闪光型发光反响,其发光时间较短。由于时间区分及偶合回路技术的使用,对于背景的去除更为有效,使得化学发光的检测灵敏度到达0.1pg用于检测化学发光的光导纤维末端带有一喷头,用来加人反响性底物。反响性底物从100个小孔喷出,使反响性底物参加孔中后即可均匀混合。发光反响同时启动后,可马上进展测定,对于闪光性化学发光的测定更为有利。激发荧光检测型激发荧光检测仪在传统仪器的根底上,用连续的激发光谐和测定光谱取代固定光谱,使模型的建立更具备敏捷性。荧光检测方法灵敏是由于多数荧光基团都有短暂的半衰期,即使用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可承受的荧光模式,使得荧光检测技术成为高通量筛选必不行少的应用手段。荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中,包括荧光共振能量转移(FRET),荧光偏振(FP),时间区分荧光(TRET)以及荧光相关谱(FCS)等技术。据统物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进展多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库治理系统4个方面的功能。样品库的治理功能:化合物样品库对进展高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进展存储治理。对每一个入库的化合物进展颖性分析,排解构造雷同的化合物,避开不样品库对入库的化合物进展反响基因检测以去除这类化合物。生物活性信息的治理功能:生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果,并依据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进展综合评价。对高通量药物筛选的效劳功能:高通量药物筛选的工作量大,自动化程度高,也涉及到很多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库治理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案治理以及各种样品标签的打印进展治理,使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。药物设计与药物觉察功能:高通量药物筛选产生大量的化合物构造信息,随着筛选的进展,生物活性信息也特大幅度提高。高通量药物筛选数据库治理系统通过对同一模型不从而为药物设计供给参考。用于检测药物作用的试验方法。由于高通量筛选要求反响总体积小,而且,反响具有较高特异性和敏感性,因此对于筛选模型也要求较高,常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平,观看的是药物与分子靶点的相互作用,能够直接生疏药物的根本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反响方面。近年也消灭了基因水平的药物筛选模型,使药物筛选模型的范围更为广泛。以酶为靶的高通量筛选以酶为作用靶的高通量筛选方法,绝大多数是直接检测酶活性。具体方法依据酶的不同而不同,主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。基于放射性的方法多是将底物标记,测定放射性产物的Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制剂(抗真菌)的高通量筛选方法。将含有酶的菌丝提取物、α-淀粉酶和UDP-14C-葡萄糖参加96孔板的孔中,温孵、反响。终止反响后,滤去未被合成进入的底物。闪耀计数检测滤器上保存的(1,3)β-葡聚糖,指示酶活性大小。也有将酶标记,测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶,该法是筛选其糖基转移构造域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenomycin)96孔板,然后参加3H标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合物,孵育、过滤去掉非结合的放射性,闪耀计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的状况及受试化合物对其影响。另外,基于放射性而无需过滤分别的SPA也有应用。Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法,用以争论其抑制剂。用3H标记的肽底物,通过生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA3H随肽的断裂而离开闪耀球。测定3H放射性作用于闪耀球产生的闪耀信号的丧失量,即指示酶活性大小。基于比色、荧光等的方法有一些报道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制剂的筛选方法。酸性条件下,脂的过氧化物能把Fe2+氧化为Fe3+,然后氧化二甲酚橙(xylenolorange)620nm96孔板上测定。ZhangHIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的高通量筛选方法。方法使用了“同质时间区分荧光”(homogenoustimeresolvedfluorence,HTRF)技术,既实现了非分别操作(同质),又避开了放射性同位素的使用。该方法基于逆转录酶能很简洁地将核苷酸类似物(如生物素-11-dUTP)引入生DNA96384孔板上,将生物素化的引物/模板与抗生蛋白链菌素-铕在板孔中混合孵育,参加逆转录酶,再参加生物素-dUTPd-TTP60min和素-别藻蓝蛋白(streptavidin-allophycocyanin),孵育,用HTRF读取数据。该法也可用于多种其他的核酸聚合酶。以受体为靶的高通量筛选其次信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反响的优点是易于区分感动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低,而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量,既高效且节约本钱。检测其次信使或下游机制如磷酸化,传统方法也比较麻烦,不适于高通量检测,但将这些机制与报告基因相偶联则能抑制。以离子通道为靶的高通量筛选Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点,用放射性配体(3H-STX)进展竞争性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子,查找型钙通道拮抗剂。以核酸为靶的高通量筛选Hamasaki16SrRNA编码区构造和HIV-RRERNA构造为靶的抑制剂的高通量筛选方法。查找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更高或作用于一样核酸的其他位点的化合物,以及不易被代谢失活的化合物。方法RNA时,芘的荧光被淬灭的原理。在96(PCP),RNA构造配成溶液后参加有受试化合物的板孔中,用荧光读板器考察荧光恢复的程度。以细胞功能为根底的高通量筛选内皮细胞激活内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要的组成环节。Rice等以E选择蛋白在细胞外表的表达作为标志,建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培育系统。IL-1刺激下,E选择蛋白在内皮细胞外表的表ELISA合物等操作,能保持细胞完整,不昂贵,可重复,筛选速度可达每星期1000用细胞作为检测对象,使能够较早地觉察细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。细胞凋亡Erusalimsky等建立了型细胞凋亡调整物的高通量筛选方法。细胞预先用3连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的,捕获完整的染色质和高分子量DNA。另一个装有DEAE活性基团,捕获低分子DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量,可以对DNA的裂开状况定量。抗肿瘤活性Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法,考察受试分子(类维生素A及类维生素A相关分子)对很多不同细胞系的效应特点。检测指标包括:(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5d后,用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测,用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞,暴露于受试物肯定时间。然后对细胞进展清洗,植于无受试物的培育介质共7d。用结晶紫对细胞染色,考察集落形成状况。(3)凋亡检测,用ELISA方法测量细胞DNA裂开。(4)转录调控检测,用以考察受试化合物是否有类维生素A受HeLaTK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染,与受试物一ELISACAT活性。G2检查点(G2checkpoint)Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法MCF-7mp53细胞培育,种在96孔聚苯乙烯组织培育板G2静止期,参加受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式,从而得到从G2G2检查点程度。信号转导通路Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量筛选方法。构建TGFβ高诱导的克隆。将细胞植于96释并参加Steady-Glo计算相对酶活性增加值。细菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告SecA干扰时,该报告基因被诱导。细菌生长Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌,因其具有生长快速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶,考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。96孔板的形式,1d内可以测试数千个样品。生药活性成分的高通量筛选样品是高通量药物筛选的物质根底,样品库来源的化学多样性是打算高通量筛选技术能否成功的关键因素之一。前面我们谈到,化合物样品主要有常规化学合成、组合化学合成和从自然产物中分别纯化几个来源。而从自然产物中分别出来的化合物,由于其母核构造和活性基团是长期的自然选择形成的,它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物觉察中具有人工合成化合物所不能比较的优势。我国拥有格外丰富的药材资源,几十年来,我们应用药理学手段,对我国的传统药物进展了大规模的争论和筛选,取得了巨大成就。但是,仅仅依靠传统的药理试验方法,既耗时,劳动强度又大,还需要使用大量试验动物,明显不能提取、纯化出大量化合物,但由于争论手段的落后,使大量分别出的化合物得不到充分的利用,造成了化合物资源的极大铺张。因此,将高通量筛选技术应用于生药的活性成分争论,既是对高通量筛选技术的不断完善,又是将这一技术应用于中药现代化争论的有益尝试。如何对生药的活性成分进展高通量筛选呢?其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选根本全都,区分主要在于筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进展适当的分别和化学多样性的评价。一样的就不再赘述,这里主要谈一下提取、分别和多样性评价的问题。提取由于高通量筛选需要大量的样品来源,所以常规的提取方法明显不能满足这一要求。查找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提取技术是近年来进展起来的一个的提取技术,在预备好样品和对提取方法〔或程序〕进展设定后,自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品的提取和提取液的收集,简洁便利。应用这一技术,可以得到大量的生药的提取物。分别及化学多样性评价我们都知道,生药的化学成分相当简单,通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物,所以筛选前需要对生药的提取物进展适当的分别。在众多的分别手段中,制备型HPLC应当是最为抱负的,它具有快速、高效、自动化等

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