教育学教育学硕士基因工程

教育学教育学硕士基因工程第1页/共92页

基因工程是70年代以后兴起的一门新技术，其主要原理是应用人工方法把生物的遗传物质——脱氧核糖核酸（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传特性；或使重组DNA的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就称为基因工程，也称DNA重组技术。1、基因工程的含义第2页/共92页基因工程的名称GeneticengineeringGeneengineeringGenemanipulationRecombinantDNAtechniqueGenecloning第3页/共92页基因工程的意义

按人们意愿，进行严密的设计，通过DNA重组和转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短时间内趋于完善，创造出新的生物类型。

打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。

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不同基因具有相同的物质基础基因是可分割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制传递给下一代

基因工程理论依据第5页/共92页生物技术的大范畴

传统生物技术，是指旧有的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食品的传统工艺；

现代生物技术，是指上世纪70年代末80年代初发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程为核心的新兴学科。2、基因工程与生物技术第6页/共92页生物技术的定义

生物技术（Biotechnology），有时也称生物工程（Bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。因此，生物技术是一门新兴的、综合性的学科。第7页/共92页生物技术涵盖内容基因工程(Geneengineering)细胞工程(Cellengineering)发酵工程(Fermentationengineering)酶工程(Enzymeengineering)蛋白质工程(Proteinengineering)第8页/共92页生物技术五大工程之间的相互关系基因工程处于核心地位第9页/共92页生物技术树第10页/共92页生物技术所涉及的行业种类

第11页/共92页生物技术基本特征

“六高”

高效益，可带来高额利润高智力，具有创造性和突破性高投入，前期研究及开发需要大量的资金投人高竞争，时效性的竞争非常激烈高风险，由于竞争的激烈，必然带来高风险高势能，对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响，具有很强的渗透性和扩散性，有着很高的态势和潜在的能量。第12页/共92页生物技术对经济社会发展的影响

改善农业生产、解决食品短缺提高生命质量，延长人类寿命解决能源危机、治理环境污染制造工业原料、生产贵重金属第13页/共92页基因工程的准备阶段1934年，Avery证明DNA是基因载体，1953年Watson和Crick，双螺旋模型，1958年至1971年先后确立了中心法则，1972年首次构建了一个重组DNA分子。

基因工程问世1973年，Coben等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化3、基因工程发展和影响基因工程的迅速发展阶段1980年第一个转基因动物――转基因小鼠，1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因烟草。1986年首次批准转基因烟草进行田间试验。第14页/共92页第15页/共92页GlobalAreaofBiotechCrops,1996/2010BiotechCropsOver1BillionHectaresin2010Source:CliveJames,201102004006008001000120019961997199819992000200120022003200420052006200720082009201004949881482247119762965MAcres500MillionHectares1BillionHectares=USAlandarea10years5yearsMHectares第16页/共92页第17页/共92页第18页/共92页转基因抗虫棉花第19页/共92页转基因抗除草剂大豆第20页/共92页第21页/共92页1.提高全球农作物产量，以有利于保持生物多样性的可持续作物生产体系来增加食物、饲料和纤维生产2.有助于减少贫困和饥饿3.减少农业对环境的不利影响

4.缓和气候变化，减少温室气体排放

5.有助于节约生物燃料生产成本

转基因作物的贡献第22页/共92页

提高产量和增加收入–1996to2009农业收入$650亿44%由于减少成本

56%由于产量增加（22900万吨）

生物多样性保护

–在15亿公顷土地上进行两熟制

–节约森林面积开垦（22900万吨

粮食相当于需要7500万

公顷土，保护生物多样性 –提高农业生态环境保护

––1996-2009节约39300万公斤

农药（节约9%）

–

2009节约180亿公斤CO2排放

–水、土壤保持

社会效益

–2010种植转基因植物的小农户达1440万户

转基因作物的效益

第23页/共92页Source:SteinandCerezo,2010

转基因作物的发展（2011-2015）

第24页/共92页Source:CliveJames,2011ISAAAPredictionfor2ndDecade,2006-2015200620102015BiotechCountries2229~40FarmersPlantingBiotechCrops10Million15.4Million~20

Million

GlobalBiotechAream.hectares100MillionHectares148MillionHectares~200MillionHectares第25页/共92页1、基础研究

表达载体（核心环节）在基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”称为载体。载体的化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体多为经过改造的质粒DNA。四、基因工程研究内容第26页/共92页原核生物的表达载体Ti质粒的发现以及成功地构建了Ti质粒衍生的表达载体后，植物基因工程研究随之就迅速发展起来。动物病毒表达载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。第27页/共92页第28页/共92页第29页/共92页作为基因工程的载体一般必须具备以下基本特性：1.在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子；2.载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，允许外源基因插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增；3.载体DNA中有1—2个筛选标记，赋予宿主细胞新的特性，便于重组子的筛选；载体不含对受体细胞有害的基因4.分子量小，多拷贝，易于操作。第30页/共92页

受体系统

受体是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体

原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统。

酵母菌是十分简单的单细胞真核生物。高等植物一般用愈伤组织、细胞和原生质体，

动物生殖细胞或胚细胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物，以及克隆羊。

人的体细胞同样可作为基因工程的受体，转基因细胞系用于病理研究。第31页/共92页

目的基因

基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。获得基因通过构建基因组文库或cDNA文库，PCR直接从某生物基因组中扩增。人工化学合成与医药相关的基因，抗病虫害和恶劣生境的基因，编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。1998年完成基因组测序的生物有11种，人类基因组于2002年宣告人类基因组计划已经基本完毕，已破译了近万个基因。“水稻基因组计划”第32页/共92页基因分离的基本步骤1、材料选择和DNA分子的片段化2、外源DNA片段和载体的体外连接3、体外重组的DNA导入寄主细胞进行复制4、具有重组DNA的转化子的筛选和繁殖5、基因功能鉴定第33页/共92页第34页/共92页

工具酶基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶。限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA，已有上千种，PCR的耐热性DNA聚合酶有Taq酶，修饰DNA分子的有甲基化酶

第35页/共92页能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA双链的核酸内切酶。GGTACCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’限制性核酸内切酶

（restrictionendonuclease）第36页/共92页

限制性核酸内切酶的类型特性I型II型III型限制与修饰活性单一多功能核酸内切与甲基化分开双功能蛋白质结构3种亚基单一成份2种亚基识别序列特异特异（对称）特异切割位点距识别位点1000bp随机切割识别序列内或附近距识别序列30bp处序列特异的切割不能能能在DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大第37页/共92页新技术研究（以PCR为例）长片段PCR技术、反转录PCR技术、免疫PCR技术、套式引物PCR技术、反向PCR技术、标记PCR技术、复合PCR技术、不对称PCR技术、定量PCR技术。錨定PCR技术、重组PCR技术等等第38页/共92页第39页/共92页PCR技术的基本原理通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性配对，耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异性DNA片段成百万倍地扩增。第40页/共92页第41页/共92页引物(Primer)与待扩增的特定靶DNA区某一末端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段。第42页/共92页PCR引物的种类：Watson引物（引物1）：序列与正义链互补Crick引物（引物2）：序列与反义链互补第43页/共92页PCR引物的长度：一般长：15-30bp引物太短，可能同非靶序列杂交，扩增出非预期的产物。过长的引物与模板DNA的杂交速率下降，也会减低PCR的效率第44页/共92页PCR引物的设计原则①应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②引物内不能碱基互补形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤四种碱基要随机分布。⑥引物之间不能有连续4个碱基的互补。第45页/共92页转化方法研究（植物）a、农杆菌介导b、聚乙二醇（PEG）、电激仪c、基因枪、激光微束c、子房注射、花粉管导入d、nanoreagentsforgenetictransformation第46页/共92页目前双子叶植物基因转移的常用方法。根癌农杆菌的Ti(Tumerinduce)质粒和发根农杆菌的Ri(Rootinduce)质粒上的一段T-DNA区可以转移到植物细胞并插入到染色体中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列,即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。迄今所获得的近200种转基因植物,80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。农杆菌介导法第47页/共92页根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）第48页/共92页细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。第49页/共92页根癌农杆菌的Ti质粒200-500kb的双链环状DNA分子，具有五个主要功能区域，T-DNA、质粒转移、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。直接参与转移并整合的序列仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。第50页/共92页Rightborder5’-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN-3’Leftborder5’-TGGCAGGATATATNNNNNTGTAAAN-3’RightLeftTherightandleftbordersoftheT-DNAoftheTiplasmidare25bpdirect“repeats”importantformobilizationoftheT-DNAbyvirgeneproducts

第51页/共92页ThegenerationofatransgenicplantthroughthegrowthofacelltransformedbyT-DNA.infection第52页/共92页基因枪法基因枪法又称微弹射击法。基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。在禾本科作物上应用较广泛。第53页/共92页基因枪转化的操作步骤靶细胞或组织的预处理微粒子弹的制备装备基因枪轰击过渡培养进行筛选培养或直接分化再生植株第54页/共92页PDS-1000|HeSystem便携式基因枪第55页/共92页第56页/共92页基因枪法转化的优点有：

无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。

靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。

载体简化：基因序列

操作简单快速但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。第57页/共92页a、抗病毒病方面，以转移病毒外壳蛋白（CP）基因b、抗虫方面，苏云金杆菌的Bt杀虫晶体蛋白基因c、抗除草剂方面，将除草剂甘膦的靶酶（EPSPS）的cDNA转入油菜2、植物转基因应用研究第58页/共92页根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传个体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。什么是转基因作物（geneticallymodifiedcrops）?第59页/共92页转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选第60页/共92页转基因个体生长快，个体大，瘦肉率高，饲料利用率高转基因动物第61页/共92页生物发生器英国研制成功的转基因羊，其乳汁中含有a[1]—抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。病人以前只能依赖于注射人的a[1]—抗胰蛋白酶做替代疗法，

价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。

第62页/共92页基因工程与药物许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。第63页/共92页基因工程药品基因工程人干扰素α-2b（安达芬）

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美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类产品数量疾病种类产品数量感染性疾病39心脏病26神经系统疾病28呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病19皮肤病19移植13消化系统疾病11遗传疾病11血液疾病9糖尿病及并发症7不育症5眼病3生长发育不良症3骨质疏松2妊娠预防2肿瘤疾病175

第65页/共92页基因工程胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子结构第66页/共92页基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素分子结构第67页/共92页基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。第68页/共92页其它基因工程药物人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产第69页/共92页基因诊断运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞第70页/共92页基因治疗－SCID重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。第71页/共92页基因工程解决肥胖肥胖对健康的影响相当于衰老20年，每年花费$1000亿以上。肠道和脂肪组织释放控制食欲的信号到大脑，信号激素之一是来普汀（leptin)，它由脂肪细胞制造。高水平可抑制食欲，不能稳定和持续产生来普汀的人总是饥饿而变成肥胖。但有些肥胖者的来普汀水平比较高，用来普汀治疗无效。Monsanto公司通过改造作物来改进食品的营养。－3脂肪酸能降解心血管疾病发生率，－3脂肪酸来自藻类，将该基因转入大豆，就可产生该脂肪酸。第72页/共92页（1）食品工业转基因食品－－转基因动物和植物,转基因食品渗透到食品工业的各个方面，转基因食品工业产值达2500亿美元生物反应器－含疫苗的农作物、水果基因工程生产激素－增加产奶量和瘦肉型化的重组生长激素；改变奶成分－除去乳糖和乳球蛋白，高酪蛋白，品质育种—提高小麦硬度，减少对淀粉的破坏，提高米的品质；控制小麦谷蛋白亚基的数量，改善面粉的粘弹性等3、生物技术在其他方面的应用第73页/共92页（2）石油工业（A）利用微生物勘探石油（B）油污及其他有机物、污水的处理：自然状态和人为施加微生物

第74页/共92页(3)化工工业（A）农药残留，出口减少，（绿色壁垒），生物技术将为化学工业带来革命。农业重组微生物生产“复合生物农药”，已达30多种，优点是：无毒、广谱性高，（B）葡萄球菌的耐药性，使用化学药品消毒将被复合酶（一种生物酶：溶葡萄球菌酶）－“生物消毒”技术所取代第75页/共92页(4)化妆品工业第一代化妆品：单纯物理保护性能的普通油脂类化妆品第二类化妆品：油水混合化妆品第三类化妆品：由天然植物提取物制成

第四代仿生化妆品：用生物技术制造与人体结构相仿，且具有高亲和力的生物精华物质的仿生化妆品

多糖物质可降低皮肤羟脯氨酸含量，加速损伤上皮组织的修复，能有效保护皮肤水分，防止皮肤老化。磷脂类物质具有保湿、养肤双重功效。

透明质酸:解决色素沉着问题，起到美白护肤作用

第76页/共92页五、基因工程的安全性

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国际上典型的转基因作物的安全性事件Pusztai事件：英国Rowett研究所Pusztai博士，用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。

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斑蝶事件：康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章（1999），声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼虫死亡。这一结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外５米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用１０倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。

斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。

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加拿大“超级杂草”事件：在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而认为是转基因的基因漂流而产生的“超级杂草”，怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说，小麦由Ａ、Ｂ、Ｄ三个基因组组成，它是由分别带有Ａ、Ｂ、Ｄ基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。第80页/共92页中国Ｂt抗虫棉破坏环境事件：

2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，６月４日《Chinadaily》上发表了题为“GMCottonDamageEnviroment”的文章。绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。６月５日德国《农业报》发表了题为“中国研究：Ｂｔ棉破坏环境巨大”。绿色和平组织的“中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级害虫”、“转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。

事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。第81页/共92页2009年10月农业部审批发放转植酸酶基因玉米和转抗虫基因水稻安全证书，这是中国首次颁发转基因水稻的生产应用安全证书。中国将可能成为世界上第一个种植转基因主粮--水稻的国家。转基因水稻是由华中农业大学所研发：在华恢1号和汕优63这两种水稻品种中转入具有Bt抗虫蛋白的基因Cry1Ab/Cry1Ac。引起争论第82页/共92页百名学者致信人大呼吁立即停止转基因粮食种植国内外的许多动物实验都表明了转基因食物存在潜在危险。欧盟和日本一直对转基因食物持否定态度，美国也没有将主粮转基因化。农业部有关部门批准其转基因商业化生产，实在令人费解。中美两国科学家对转基因棉花跟踪七年的调查表明，转基因棉花的优势在第三年发生逆转，不仅产量下降，使用农药等农化产品也会大幅度上升。

转基因主粮化的生物安全存在不确定性，商业化生产后的经济安全存在不确定性，绿色优势也存在不确定性，更大的忧虑在于转基因作物商业化生产后的不可逆性，将安全性仍然存在广泛争议的转基因食物主粮化，有可能危及民族与国家安全。第83页/共92页院士大力推进生物技术研究与应用

袁隆平：虽然中国杂交水稻技术目前在国际上领先，但如果不加强分子育种技术研究，短则5年、长则10年，中国的杂交水稻技术就要落后国际水平了。陈君石：天然食品不等于就是安全食品；没有零风险食品存在；转基因食品不构成食品安全问题。许智宏：中国生物产业发展大力推进转基因生物品种研发与产业化，对于建设创新型国家、增强中国在高新技术领域核心竞争力、保障中国粮食安全和农业可持续发展，均具重要战略意义。

李家洋：面对全球日益严峻的粮食安全问题，可利用转基因生物新品种培育、生物农药和