蛋白质结构与功能及研究方法

蛋白质的结构与功能为什么研究蛋白质的结构与功能对蛋白质结构和作用机理的深层次理解对蛋白质结构进行改造的基础对蛋白质功能的控制“随心所欲”创造具有新功能的蛋白质血红蛋白的结构、功能及镰刀形贫血病血红蛋白（Hemoglobin,Hb)Hb(Mr64500)几乎呈球形(d=5.5nm)，四聚体，每个亚基含一个血红素(heme)辅基，2个亚基(141AAs)和2个亚基(146AAs)。亚基的三维结构相似(与肌球蛋白的一致)。血红蛋白的四级结构显示了不同亚基间强的相互作用。11界面(22)间存在强相互作用，即使用尿素处理，得到的是完整的二聚体，界面间是明显的疏水作用，但也存在许多氢键和一些离子对作用。结合氧后引起结构改变

血红蛋白有两个主要的构象：R态(relaxed)和T态(tense)，氧可以与两种状态结合，但对R态的亲和力更大。无氧结合时，T态更稳定，表现出去氧血红蛋白的主要的构象。T态因更多的离子对作用更为稳定，其中的多数存在于12（及21)界面间。氧与Hb一个亚基的T态结合，引起构象改变为R态，当整个蛋白质发生这样的构象改变，单个亚基的结构几乎没有改变。但亚基对相互滑动和旋转，使得亚基间的口袋变窄。这一过程中，稳定T构象的一些离子对被打破，同时产生一些新的离子对。去氧血红蛋白的T状态►►TR转变。带正电荷的侧链（蓝色）和带负电荷的侧链（粉红色）形成离子对。每个亚基的LysC5和每个亚基的AspFG1能够看到，未作标记。结合氧的血红素附近的构象变化。MaxPerutz假定TR的转变是由于血红素周围几个关键氨基酸侧链位置的改变所引起的。T态的血红素轻微皱褶，引起血红素铁突出His的侧链。氧的结合引起血红素呈现更平坦的构象，将His侧链改变而接触F螺旋。S形（协同）结合曲线。可以看成反映低亲和与高亲和状态转变的杂合曲线。表明血红蛋白在组织和肺之间对氧浓度微小差异更为敏感，使得血红蛋白在高氧分压的肺中能够结构氧，在低分压的组织释放出氧。pH对氧与血红蛋白结合的影响。肺中血液的pH为7.6，组织的血液pH为7.2，实验测定血红蛋白与氧的结合在pH7.4。氧与血红蛋白的结合受

2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的调控2,3-二磷酸甘油酸(BPG)与Hb的作用表现为一种向异性的变构调控行为。红细胞中BPG的浓度相对较高。BPG能大大降低Hb对氧的亲和力。

HbBPG+O2HbO2+BPGBPG结合Hb的位点与氧的不同，可以调控肺中与氧分压相关的氧与Hb的亲和力。高纬度时，BPG对于较低氧分压的生理适应起着重要作用。健康人体在海面上能释放40%的氧进入组织，如果被迅速转移到4500米的山上(pO2低)，其向组织释放氧的能力降低。几个小时后血液BPG的浓度上升，降低Hb与氧的亲和力，这种调节对于肺中氧的结合影响不大，但对组织中氧的释放影响很大，可以恢复释放血液携带氧的40%进入组织。正常人位于海平面时血液中的BPG约为5mM，高纬度时约为8mM。BPG与去氧血红蛋白的结合。BPG的结合稳定去氧Hb的T态(a)，BPG所带负电荷与T态亚基口袋周围的正电荷侧链作用(b)，由于氧的结合，T态转变为R态，BPG结合的口袋消失(c)。血红蛋白分子病MolecularDiseaseofHemoglobin有时候蛋白质上的一个点突变会造成对蛋白质结构和功能的巨大影响镰刀状细胞贫血病（Sickle-CellAnemia）基因变异直接影响蛋白质特性，表现出不同遗传性状。例如人的镰形红血球贫血症。红血球碟形HbA

HbS

突变

HbC

红血球镰刀形血红蛋白分子有四条多肽链：两条α链(141个氨基酸/条)；两条β链(146个氨基酸/条)。

HbA、Hbs

、Hbc氨基酸组成的差异在于β链上第6位上氨基酸（亚基完全相同）：

HbA第6位为谷氨酸（GAA、GAG)；

HbS第6位为缬氨酸（GUA、GUG)；

HbC

第6位为赖氨酸（AAA、AAG）由于链一个氨基酸的突变（6Glu6Val），去氧血红蛋白S的表面换成了一个疏水侧链，进一步引起分子发生线性缔合，形成长链，多条长链进一步聚集成多股螺旋的不溶性纤维。HbS与HbA的四级结构差别不大，但在低氧（脱氧）时，HbS的溶解度急剧下降（为正常脱氧Hb的1/25）。产生贫血症的原因：

单个碱基的突变引起氨基酸的改变导致蛋白质结构发生变化，直接产生性状变化。正常碟形红血球转变为镰刀形红血球缺氧时表现贫血症。HbA

HbS

HbC蛋白质结构与功能的

关系及其研究方法X-Ray衍射NMR(核磁共振)MolecularModelingMutation/Function(分子生物学)结晶困难分子量不能太大理论不太完善费时费力内容1、免疫体系中分子间的识别机制2、DNA与蛋白质的相互作用3、蛋白水解酶与疾病4、膜蛋白、受体与信号转导5、酶抑制剂与药物开发6、新技术与新方法

免疫体系分子的相互识别HelperTcell

--免疫体系的关键细胞

辅助T细胞巨噬细胞-吞噬抗原-加工抗原-递呈给休止的辅助T细胞-辅助T细胞被活化-（1）激活免疫系统攻击已识别的抗原；（2）激活B细胞；（3）增生杀伤T细胞MHCIIKillerTCell

--保卫我们的主要战士杀伤T细胞对抗入侵细胞的卫士，但必须激活，首先要识别和结合特定的抗原片段-递呈抗原-MHCI-激活的杀伤T细胞进攻带有识别抗原的病毒并消灭之。MHCI两种T细胞上的MHC分子是特异性识别的关键主要组织相容性复合体

(MajorpatibilityComplex，MHC) 早期从组织器官移植实验中发现，也是当今免疫遗传学的主要内容。已发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移植时出现的排斥反应，具有记忆性、特异性和可转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪40年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫现象。引起排斥反应的抗原称移植抗原(transplantationantigen)或组织相容性抗原(patibilityantigen)。此等抗原存在于细胞表面，无器官特异性，不同个体间其抗原特异性互不相同，但同卵双生及纯系动物不同个体之间，其抗原特异性完全一致。Ⅰ类分子构槽(A)和Ⅱ类分子构槽(B)示意图人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)。HLAI类分子HLAII类分子MHCIⅠ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构，α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋，呈对称排列而连接成一个沟槽，β片层组成槽底，其两侧由α螺旋组成。沟槽大小为2.5nm×1.0nm×1.1nm，可容纳8-12个氨基酸残基组成的短肽。沟槽内氨基酸变化大，是Ⅰ类抗原多态性的基础。虽然抗原肽与Ⅰ类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原与抗体那样高度特异地结合，只要被结合的多肽有2-3个关键的氨基酸能恰当地连接到沟槽内的多肽结合基序(bindingmotif)的相应位置上，多肽即可与之结合，并被运送到细胞表面递呈给T细胞。所以每个Ⅰ类抗原分子能与一定广度的多肽谱结合。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α3三个功能区。跨膜区含疏水性氨基酸，排列成α螺旋跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性，与α3功能区连接，其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性。MHC1分子的结构容纳抗原的口袋MHCII，α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12-20个氨基酸)。该沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。。Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链在内质网分别合成后，很快与第3条链—γ链(或称Ii链)结合成αβγ复合体，当复合体到达（内体/溶酶体样结构)，γ链解离、降解。γ链的存在，使α、β链不能与其他胞内蛋白结合，并协助αβ复合体转运到MHC，使之与抗原结合。α链和β链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β１、β2蛋白质与DNA的相互作用Helix-Turn-Helix(HTH)Helix-Loop-Helix(HLH)Zinc-fingerLeucinezipper非特异性:特异性:HistonesDNA-蛋白质相互作用的化学键1、氢键:具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。2、疏水键：暴露于大沟侧缘的T-CH3基团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。3、离子键：蛋白质的带电的氨基酸残基的侧链与DNA分子上的带电基团形成离子键。组蛋白（Histone)

组蛋白（与DNA非特异性结合）组蛋白带正电荷，含Arg、Lys，碱性蛋白，含量恒定，真核细胞中组蛋白共有5种，分为两类：一类是高度保守的核心组蛋白（corehistone）包括H2A、H2B、H3、H4四种；另一类是可变的连接组蛋白（linkerhistone）即H1。核心组蛋白的结构是非常保守，特别是H4，牛和豌豆H4的102个氨基酸中仅有2个不同。核心组蛋白高度保守的原因可能有两个：其一是核心组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少；其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二酯骨架都是一样的。

四种核心组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合，N端带正电荷的氨基酸向外伸出，与DNA分子结合，使DNA分子缠绕在组蛋白核心周围，形成核小体。尾部含有大量Lys和Arg残基，为组蛋白翻译后进行修饰的部位，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。

H1不仅具有属特异性，而且还有组织特异性，所以H1是多样性的。核小体的结构要点

每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1。由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成盘状核心颗粒；H3、H4形成4聚体，位于颗粒中央；H2A、H2B二聚体分别位于两侧。

DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合，H1

结合20bpDNA.

相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA(linkerDNA)，典型长度60bp。组蛋白与DNA是非特异性结合，核小体具有自主装性质。非组蛋白

非组蛋白是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结合蛋白（凝胶迟滞电泳实验）。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、基因表达和染色体结构调节蛋白等。（1）非组蛋白的特性①含有较多的Asp和Glu，酸性蛋白质；②整个细胞周期都进行合成，不象组蛋白只在S期合成，并与DNA复制同步进行；③能识别特异的DNA序列，识别信息存在于DNA本身，位点在大沟部分，识别与结合靠氢键和离子键；④具有多样性和异质性；⑤具有多种功能，如帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于DNA的复制和基因的转录，协助启动DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。（2）序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式①螺旋-转角-螺旋模式（HTH)

蛋白质形成对称的同型二聚体，每个单位由20个氨基酸的小肽组成，两个螺旋相互连接成β转角。羧基端的螺旋负责识别DNA大沟的特异碱基信息，另一个螺旋与磷酸戊糖链骨架接触。②锌指模式

(ZincFinger)

每个锌指单位是一个DNA结合结构域，由30个左右氨基酸残基组成，其中一对Cys和一对His与Zn2+形成配位键，锌指的C端形成

螺旋负责与DNA结合。③亮氨酸拉链式模式(LeucineZipper)

蛋白质肽链的羧基端约35个氨基酸残基有形成a螺旋的特点，每两圈（7个氨基酸残基）有一个Leu残基。螺旋一侧的Leu排成一列，两个蛋白质分子的螺旋间靠Leu间疏水作用力形成一条拉链状结构。HTHMotif

最初发现于λ噬菌体的阻遏蛋白中，现发现在很多原核及真核DNA结合蛋白中存在。由两个较短的α螺旋与其间含Gly残基的绞链组成。如大肠杆菌的CAP蛋白含一HTH结构域，HTH通过DNA双螺旋大沟识别、结合反向重复序列TGTG/CACA。蛋白质与DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子识别机制锌指结构(ZincFingerStructure)

锌指结构：基因调控的转录因子存在于致癌基因、果蝇控制发育的基因、受生长因子和分化信号诱导合成的蛋白质序列中。

锌指区域：由四个Cys或二个Cys及二个His组成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。

锌指蛋白：2~13个手指，各由23氨基酸组成，并由7~8个氨基酸连接；与DNA大沟结合并环绕DNA分子，大沟与特异DNA碱基互作。Zinc-finger蛋白结构特征指状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个Cys或2个Cys和2个His相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。如与GC框结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。Cys2/His2锌指结构12AAs碱性亮氨酸拉链

(bZIP)

可形成蛋白质－蛋白质二聚体的亮氨酸拉链

(leucinezipper，LP)；具有35个氨基酸残基，其中有4个亮氨酸，每7个氨基酸出现一次，形成α-螺旋时，每两圈伸出一个亮氨酸，由亮氨酸残基间的疏水作用力形成一条拉链，产生蛋白质二聚体； 碱性α-螺旋与DNA磷酸残基和碱基互作，二聚体剪刀结构。Leucine-zipper的结构特征蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。这类蛋白质能够与CAAT框和病毒增强子结合，其特征就聚体形成域是能形成bZIP二聚体结构。LeucineZipper蛋白的剪刀型结合模式足迹法研究DNA结合蛋白的结合位点

DNAFootPrinting

足迹法技术用于测定与特殊蛋白质结合在DNA上的结合位点和相应的核苷酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点（启动子）的核苷酸顺序。研究蛋白质在DNA上的结合位点的FootPrinting由含70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子蛋白水解酶与人体疾病Cardiovasculardiseases心血管疾病HemophiliaA/B血友病Programmedcelldeath/appotosis细胞凋亡Alzheimerdisease痴呆Cancermetastasis癌细胞转移Pulmonaryemphysema/pancreatitis/arthritis

肺气肿/胰腺炎/关节炎Parasitedisease:malaria/Tcruzain疟疾InfluenzaA&AIDS甲型流感与爱滋病细胞内蛋白质有确定的寿命

Proteosome是蛋白质降解的专业机构蛋白质降解的泛素—蛋白酶体途径

泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸相连。蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段。此为生物大分子在胞质中降解的泛素—蛋白酶体途径(ubiquitin-proteosomepathway)。泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象。蛋白质降解的泛素—蛋白酶体途径

蛋白质泛素化系统由3个组分构成，一个称为泛素激活酶E1，它可利用水解ATP释放的能量以其Cys的巯基与泛素C端的Gly形成高能硫酯键。然后连接在其上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白Lys-NH2基团形成异肽键(isopeptidebond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。血栓形成（Thrombosis）

活体心脏、血管内血液的某些成分析出，凝集形成固体质块的过程称血栓形成，形成的固体质块叫血栓。内膜损伤后血小板粘集，形成血小板小堆；以后内源性凝血系统、外源性凝血系统激活，形成纤维蛋白，血小板与纤维蛋白等形成血小板血栓，阻碍血流，血流下游形成漩涡，形成新的血小板血栓，如此往复形成不规则梁索状或珊瑚状突起，称为血小板小梁，在小梁间则由网有大量红细胞的纤维蛋白网填充。后血栓逐渐增大，阻塞血管，血流停止，血液发生凝固，形成更大血栓。血栓形成与消除1.溶解吸收

2.机化→再通

3.软化脱落→栓子→栓塞→梗死组织型纤溶酶原激活剂纤溶酶原激活物抑制物血纤维蛋白溶酶原溶纤酶甲型流感病毒与艾滋病毒流行性感冒病毒简称流感病毒，是引起流感的病原体。流感是一种上呼吸道急性传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。已引起数次世界性大流行，仅1918～1919年的世界大流行，死亡人数就达2000万，对人类的生命健康危害极大。InfluenzaVirus流感病毒（Influenzavirus）属正粘液病毒科，流感病毒属，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型（H1～H15），N有9个亚型（N1～N9）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。LifeCycleofInfluenzaAvirusA型流感病毒的H抗原蛋白的结构域受蛋白水解酶活化后才有感染细胞的能力艾滋病（AIDS)艾滋病的医学全称是“获得性免疫缺陷综合征（AcquiredImmunodeficiencySyndrome，缩写AIDS）”，其病原为“人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，缩写HIV）”。HIV专门攻击人体的T淋巴细胞，致使人体免疫功能缺陷，进而导致人体丧失了对各种病原体的抵抗能力而发生多种机会性感染、恶性肿瘤和多系统损害的综合征，最终导致死亡。外界环境中的生存能力较弱，对物理因素和化学因素的抵抗能力较低。对热很敏感，56℃处理30min可使其在体外对人的T淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的HIV，100℃处理20min可将其完全灭活。除此之外，75%的酒精也可灭活，但紫外线不能灭活。变异强：艾滋病毒的变异性很强，给研制预防性疫苗和治疗性药物带来了极大困难。易感性：人群普遍易感，无国界、无季节性。HIV感染与人类的行为密切相关，如：多性伴、吸毒等。AIDS病毒生活史有个必须的Protease癌细胞的转移需要蛋白水解酶的帮助膜蛋白、受体与信号转导白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)

细胞来源:主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。主要功能

（1）刺激活化Ｂ细胞增殖，分泌抗体；

（2）刺激Ｔ细胞增殖及CTL活化；

（3）刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；

（4）促进血细胞发育。白介素-6(Interleukin-6)的信号转导纤维细胞生长因子（FGFs）

主要来自牛脑和脑垂体的提取液，是大约150个氨基酸结构的酸性或碱性成纤维细胞生长因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性为20%~50%。其后分离的癌基因产物的细胞增殖因子与上述FGFs结构类似，也被分类在FGFs家族，并依次命名为FGF3~9。目前已发现23种FGFs。

FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。FGF的信号转导几条信号转导途径酶抑制剂与药物开发真正意义上的抗流感病毒药物ZanamivirSialicacidGS4104NA抑制剂类药物扎那米韦（Zanamivir，瑞沙）

GG167（Glaxo），为神经氨酸酶(NA)抑制物，主要用于早期流感(发病两天内)治疗，尚未被批准用于流感预防。对甲、乙型流感均有效。然而，对具有合并症的流感疗效较差，对全身性感染几乎无效。1999年美国政府正式批准其使用。奥司他韦（Oseltamivir，Tamiflu，达菲)

一种有效的抗病毒药物，用于由A型流行性感冒和B型流行性感冒病毒感染导致的流感的预防和治疗。是流感病毒神经氨酸酶(Neuramindase)的特异性抑制剂，通过抑制神经氨酸酶的作用,抑制成熟的流感病毒脱离宿主细胞，从而抑制流感病毒在人体内的传播，而起到预防和治疗流行性感冒的作用。Oseltamivir本身属于前体药（Prodrug），在肝脏内被水解后产生的活性代谢物自由羟基Oseltamivir才是神经氨酸酶抑制物。Oseltamivir分子结合在神经氨酸酶活性中心的X光衍射3维晶体图金刚烷(Amantadine)的结构作用于MatrixProtein2(M2)蛋白盐酸金刚乙胺井冈烷胺作用于DNA聚合酶的抗病毒药物病毒DNA聚合酶的抑制剂，真核生物的DNA聚合酶不敏感阿昔洛韦更昔洛韦喷昔洛韦法昔洛韦嘌呤核苷类似物，转变为相应的三磷酸核苷酸，参入复制到DNA，导致链终止，抑制DNA依赖的DNA聚合酶活性。嘧啶核苷类似物，抑制病毒DNA复制，进而导致RNA合成受阻，感染细胞DNAPol是其作用的靶部位。(E)-5-(2-溴乙烯基)-2'-脱氧尿苷氟阿糖碘胞苷氟碘阿糖尿嘧啶S-9-（3-羟基-2-磷酰基甲氧丙基）腺嘌呤西多福韦（嘌呤类）抗AIDS病毒

的药物（I）膦甲酸作用机制为直接抑制病毒特异的DNA多聚酶和逆转录酶碘脱氧尿苷利巴韦林阿糖腺苷叠氮胸苷扎西他滨2,3-二脱氧胞苷去羟肌苷二脱氧肌苷核苷类抗AIDS药物作用原理HIVprotease

作用于AIDS病毒专有的蛋白水解酶抗AIDS病毒的药物（II）Viracept(Nelfinavir,Agouron,1998)Crivivian(Indinavir,Merck,1997)Invirase(Sequinavir,Roche,1995)Norvir(Ritonavir,Abbot,1997)茚地那韦利托那韦奈非那韦沙喹纳韦计算机辅助药物设计

是新药研发的制高点特别适合抗结核病，抗爱滋病毒等药物的研发Aspirin(水杨酸)的作用靶位COX1和COX2计算机设计的Celecoxib只抑制COX2抗病毒感染药物的开发抗癌药物的研究动态化疗（Chemotherapy）药物抗转移药物单克隆抗体药物血管生成抑制药物免疫增强药物增敏药物基因治疗肿瘤疫苗PEG化的Asparaginase,等化疗药物讲究靶向特异性MMP（基质金属蛋白酶）inhibitorCdk（周期素依赖性激酶）2/cdk4inhibitor,EGFR/KInhibitorPoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorGlycinamideRibonucleotideformyltransferase(GRFT)inhibitorTelomerase（端粒酶）inhibitorappotosisblockerinhibitorArtemisinin(青蒿素),等等新方向与新技术1、Proteomics2、Proteinchips3、Display/molecularevolutionengineering4、Two-hybridsystem5、Geneknockoutmice

WhatisProteomics?

(Genome+Protein

=proteinsexpressedbyagenome)一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质ProteomeandProteomics

蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出。对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。

蛋白质组学指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

发展简史

1994年，澳大利亚学者Williams和Wilkins首先提出蛋白质组。

1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心。

NCI投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。

NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。

1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议

1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议

1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议

1998年，我国也于启动了蛋白质组学研究

2003，成立了中国人类蛋白质组组织，03-04召开国内第二及第三届蛋白质组学会议及国际蛋白质组学大会，并将其纳入863及973发展规划。FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?PMF:peptideMassFingerprinting(肽质量指纹图谱）蛋白质组学的重要技术双向凝胶电泳（2-DE）以质谱为代表的蛋白质鉴定技术，样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。

LC（分离）-MS（分子量）/MS（部分序列）多维色谱技术『LC/LC-MS/MS』，根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻。生物信息学分析。质谱分析法（Spectrometry）质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。MSidentifiesanalytesby:ProducinggasphaseionsSeparatingtheseionsaccordingtom/zratioDetectingtheionsSensitive:Detectattomole(10-18)concentrations质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱,谱图与分子结构有关。质谱是唯一可以给出分子量,确定分子式的方法,而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。离子化的方法电子轰击电离

ElectronImpactIonization,EI化学离子化ChemicalIonization,CI场电离，场解吸FieldIonizationFD,FieldDesorption，FD快原子轰击

FastAtomBombardment,FAB基质辅助激光解析电离

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI电喷雾电离

ElectrosprayIonization,ESI大气压化学电离

AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI联合技术精确鉴定蛋白质技术组织切片或印片原位质谱分析技术

两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换-回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）基质辅助激光解析电离

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization

(MALDI)MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。MALDI适用于生物大分子，如肽类、核酸类化合物。可得到分子离子峰，无明显碎片峰。此电离方式特别适合于飞行时间质谱计。飞行时间质量分析器

MassAnalysers:TimeofFlight(TOF)Developedin1950’sPopularisedin1980’sAdvantage:nouppermasslimitDisadvantage:poorresolutionR»2-5,000Timebetweeniongeneration&detectionApproximately10-7secondsVeryfastelectronicsrequiredVerylowmaintenanceItisjustanemptytube!飞行时间质量分析器SchematicDiagramofaTOFIonsacceleratedbyelectricfieldAllowedtodrifttodetector傅立叶变换质谱计

FourierTransform–MassSpectrometer,FT-MS

傅立叶变换质谱计是傅立叶变换离子回旋共振质谱计，是受FT-NMR的启迪。利用不同m/z的离子，在磁场的作用下，各自产生不同的回旋频率。若施加一射频场，使其频率等于某一m/z离子的回旋频率，则离子就会吸收能量而激发。离子从射频场吸收能量，称之离子的回旋共振。激发的离子运动速度(v)增大，运动轨道半径(r)增大，称之离子的回旋运动的激发。

如果磁场强度（B）一定，改变射频场的频率（）即可激发不同m/z的离子而得到质谱。

FT-MS的核心为分析室，分析室由三对平行的极板构成。磁力线沿z轴方向，离子的回旋运动垂直于z轴，在与x轴方向垂直的两极板上施加激发射频，在与y轴方向垂直的两极板上检测信号。

FT-MS分辨率极高，目前可得到精确度最高的精确质量。

FT-MS灵密度高，质量范围宽，速度快，性能可靠。生物芯片(Biochip)的定义生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray）。生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未来十年最具发展潜力的技术。广义上：矩阵型芯片、处理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。研究历史(ResearchHistory)1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNAChip概念Stanford大学Brown实验室：预先合成，机械手阵列1995Schena等：基因表达谱1996Chee等：DNA测序1996Cronin等：突变检测1996Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆1996Shalon等：复杂DNA样本分析1996Shoemaker等：缺省突变定量表型分析根据应用的分类基因变异检测芯片疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)法医鉴定(如DNA指纹图谱)表达谱芯片肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异)药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异)发育(同一组织不同发育时期基因表达差异)组织发生(不同组织或器官的基因表达差异)什么是生物芯片技术？以微点阵排列技术（MicroarrayTechnology）将生物大分子固定到适当的固体载体上，方便各种生化和分子生物学的操作。蛋白质芯片（ProteinChips，ProteinArray）技术基本原理：将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。依据的杂交反应原理:抗原-抗体反应配体-受体反应蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质芯片的操作过程1.将抗原或抗体交联（UV）或吸附在膜上；2.抗体或抗抗体标记示踪①酶：HRPO、AP②胶体金③荧光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻胆蛋白等3.检测标本中的抗体或抗原点抗原测抗体点抗原测抗体点抗体测抗体-捕获法点抗体测抗原蛋白质芯片筛选新药的原理受体、酶的微点阵与中草药抽提物反应后再与受荧光标记的配体或底物结合以激光进行检测不出现荧光的点表明中草药样品中含有与这些点上的蛋白质相互作用的物质，因此是作用于这些位点的新药候补荧光基因芯片操作程序经典的DNA芯片数据DNA芯片的操作过程利用半导体技术的DNA芯片酵母双杂交(YeastTwoHybrid)

技术

蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础。随着分子生物学技术的发展，特别是人类基因组计划的完成，使人类对基因的结构和功能的认识不断加深，但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题。酵母双杂交系统利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白质。酵母双杂交的原理利用酵母作为真核蛋白质相互作用的模型利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用使用不同的培养基筛选阳性克隆酵母双杂交体系

酵母双杂交由Fields等在1989年提出，是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activationdomain，AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白质－蛋白质的相互作用。主要有二类载体:a.含DNA-bindingdomain的载体;b.含DNA-activatingdomain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence,NLS)，而GAL4-ad没有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

另一个重要的元件是报道株，报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易与来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交模型DNA-BindingDomain诱饵蛋白BaitProtein捕获（猎物）蛋白PreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite模型文库筛选的步骤将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒。将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母。再将文库质粒转化到酵母中。通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。转基因动物TransgenicAnimals什么是转基因动物

将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系-转基因动物。将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物-转基因动物。转基因动物的制备程序外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系转基因鼠的制备-微注射法1980年，Gordon等人首先报道利用显微注射纯化DNA的方法获得了世界上第一只转基因鼠。1982年，美国科学家使用显微注射技术将外源的大鼠生长激素基因导入小鼠的生殖细胞，发育成的转基因小鼠比对照鼠要大上2倍，被称为“超级鼠”1983年先后获得了转基因猪、羊、鸡、兔、牛等。人和鼠有百分之九十九的基因相同1987年，首次报告从转基因鼠的乳汁中可获得有活性的人组织纤溶酶原激活剂和羊β乳球蛋白以来，通过转基因动物的乳汁获得异源性蛋白成为人们考虑生产治疗性蛋白的潜在体系。1987年，Thomas等基因定点点突变转基因鼠诞生。1988年，USPTO批准了专利历史上第一件哺乳动物专利—哈佛鼠专利，这是一只利用遗传工程方法改变了特征的转基因鼠。1989年，卡佩奇发表了里程碑式的论文，第一只基因敲除小鼠

1989年，精子介导的基因转移方法制备转基因鼠和转基因猪。1991-1992，绵阳及牛乳腺生物反应器。1995年，美国学者secheler建立转基因鼠动物模型。1997年，Wilmsut等克隆绵羊（Dolly)1999年，基因打