癌症相关静脉血栓栓塞的途径和标记物

癌症相关静脉血栓栓塞的途径和标记物［摘要］癌症患者静脉血栓栓塞的发生明显增加。导致静脉血栓栓塞的原因有很多。随着研究的深入，发现血小板、白细胞和微粒增多与癌症中静脉血栓栓塞的发生密切相关。白细胞可以通过释放中性粒细胞细胞外诱捕网促进凝血发生，微粒则主要通过表达组织因子来参与凝血。对于癌症中促进静脉血栓栓塞途径的更好的理解可能会产生新的治疗方法及作用靶点从而降低血栓形成的发生率和致死率。［关键词］癌症静脉血栓白细胞血小板微粒目录1癌症中血栓形成的发生及评估 癌症中血栓形成的发生及评估1.1癌症中血栓形成的发生率癌症与静脉血栓栓塞和动脉血栓的发生率增长有关,有研究统计发现癌症静脉血栓栓塞发生率为4-20%而动脉血栓形成发生的机率为2-5%［1-5］。目前，血栓形成已经成为导致癌症患者死亡的第二常见原因。甚至在一些并没有明显血栓形成的癌症患者中同样也可以发现明显的高凝状态，即便其并没有明显的形态学特征。1.2目前关于癌症患者静脉血栓栓塞的危险分层有趣的是，不同类型癌症其静脉血栓栓塞的发生率并不相同［5.6.7-10］。根据静脉血栓栓塞危险性的不同可以将癌症类型大致分为三组：高危（胰腺、卵巢、脑、胃、妇科及血液方面的肿瘤）、中危（结肠和肺部）和低危（乳腺及前列腺）。这说明静脉血栓栓塞可能具有癌症类型特异性。1.3目前关于癌症中静脉血栓栓塞危险分层具体方法可以通过风险评估来鉴别具有高危静脉血栓形成危险的癌症患者。Khorana评分结合多项参数如癌症发生的部位、白细胞增多和血小板增多来评估发生静脉血栓栓塞的危险率以此给接受化疗的活动性癌症患者进行危险分层［11］。根据这个评分将患者发生静脉血栓栓塞的危险性分为低危(0.3-0.8%)、中危(1.8-2.0%)和高危(6.7-7.1%)［11］。PROTECT评分在Khorana评分的基础上将化疗药物（顺铂、卡铂及胞苷）的使用也作为参与评分的重要因素［12］。另外，theViennaCATS评分则在Khorana评分的基础上添加了标记物D二聚体和可溶性P选择素来评估静脉血栓栓塞发生的可能性［13］。D二聚体的优势是在临床上可以常规的检测。最近进行的一项其中包括有53名患者患有静脉血栓栓塞在内的876名患者研究评估了在53名处于进展性静脉血栓栓塞的患者的不同的危险评分，发现他们对于静脉血栓栓塞的鉴别约为13到34%［14］。作者认为在癌症中这种预测性的评分对于预防静脉血栓形成并没有很大的作用，因此在临床上考虑引进这种评分时需进行进一步的完善。现在对于能够用来评估具有高危静脉血栓栓塞危险性的标记物已经引起了很大的兴趣［15］。大多数的研究主要集中在研究不同类型癌症中不同的标记物［16］。这种方法可能并不能检测到具有癌症特异性的标记物，因为每一种癌症样本都太小。最近有研究总结了18项研究结果及在肺癌中的用于预测血栓栓塞的36种标记物［17］，认为D二聚体及表皮生长因子突变是可重复用于预测血栓栓塞的发生。在不同癌症中的癌症相关的血栓形成的标记物及途径尚需进一步的研究。2过去对于癌症血栓研究机制的研究发现引起癌症患者中血栓形成的原因有很多。在50多年前人们主要认为凝血因子的改变、血小板粘附性的增加以及纤溶活性的减少可能是导致癌症相关血栓形成的主要机制［6］。但是，因为一般情况下，癌症患者更容易发生出血而不是血栓形成，所以对于能够活动的癌症患者来说进行常规的血栓预防并不推荐［18］。由此，在可以活动的癌症患者中，识别出那些给予预防血栓形成的措施能够达到有益效应而出血的危险性并不增加的患者是目前研究的一个主要方向［19］。3目前对于癌症相关血栓形成机制的新的发现白细胞、血小板、组织因子阳性微粒的增加都可能作为潜在的因素单独或者共同促进癌症相关血栓形成。中性粒细胞可以释放中性粒细胞细胞外诱捕网从而促进癌症患者中静脉血栓栓塞，单核细胞则可能表达组织因子发挥同样的作用。在胃肠道、肺、乳腺及卵巢癌中经常会观察到血小板增多症的发生，这会增加静脉血栓栓塞的发生。可溶性P-选择素在以前已经被发现可以作为一般类型癌症中血栓形成的标记物，并且可以激活内皮细胞。内皮细胞上表达的P选择素可能通过增加白细胞的招募从而增加静脉血栓栓塞的发生。可以用鼠模型来研究癌症中血栓前状态、白细胞、血小板及其他标记物促进静脉血栓形成的机制。的确，研究不同类型癌症中血栓形成的最好的方法是结合临床观察及进行通过鼠模型进行基础研究。3.1白细胞增多和肿瘤相关的血栓形成在1986年有一项研究报道在252名不同类型的肿瘤患者中有77名患者白细胞增多［20］。在肺和大肠肿瘤患者中观察到白细胞增多发生的更频繁。作者推断白细胞增多可能是一个额外的肿瘤相关的标记物，可以用来评估和检测非血液学恶性肿瘤的发生。一个大型的回顾性分析研究发现在3770名非血液学恶性肿瘤患者中有758人白细胞增加达到峰值，发生这种类似于白血病反应的主要原因可能是骨髓生长因子［21］。另一个研究也观察到在227名肺癌患者中有33人白细胞增多［22］。重要的是，一些患者的粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-6增加，这些似乎是肿瘤表达的［23］。最后，有研究发现在145名软组织肉瘤患者中中性粒细胞和单核细胞增多也有一个高的发生率［24］。一些研究报道增多的白细胞与癌症患者中静脉血栓栓塞发生率的增加有关，由此认为白细胞增多可能代表了癌症相关血栓形成的共同途径［11.25.26］中性粒细胞可能通过产生表达组织因子的中性粒细胞细胞外诱捕网来促进血栓形成［27,28］。癌症相关的白细胞增多的机制已经在小鼠模型中研究。有研究发现在BALB/c小鼠中老鼠乳腺癌4T1的生长与循环中中性粒细胞增加及脾脏的增大相关［29］。尽管在肿瘤模型小鼠的血清中只有粒细胞集落刺激因子增加，从小鼠身上分离的4T1肿瘤表达粒细胞集落刺激因子及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。别的研究也发现在含4T1肿瘤小鼠有类似的中性粒细胞增加［30,31］。重要的是，在含4T1肿瘤的小鼠中用抗粒细胞集落刺激因子中和可以消除中性粒细胞增多，给没有肿瘤的小鼠注射重组的粒细胞集落刺激因子则会增加循环中的中性粒细胞［32］。人类和老鼠粒细胞集落刺激因子在含有人类乳腺肿瘤MDA-MB-231的小鼠血浆中均存在，说明肿瘤细胞和宿主细胞表达粒细胞集落刺激因子［32］。我们观察到在人胰腺BxPc-3肿瘤小鼠模型中中性粒细胞增多［33］。这些研究说明造血细胞因子增加导致中性粒细胞增加，这些中性粒细胞可能释放中性粒细胞细胞外诱捕网增加血栓形成。在小鼠模型中已经发现白细胞有助于静脉血栓形成［34,35］。在下腔静脉结扎的大鼠模型中粘附的单核细胞、中性粒细胞及内皮细胞表达组织因子［36］。最近许多的研究发现，中性粒细胞活化或者凋亡之后释放入血液中的染色质可以形成中性粒细胞细胞外诱捕网。中性粒细胞细胞外诱捕网是主要由细胞内解聚的DNA、组蛋白、颗粒成分等组成，它作为中性粒细胞抗菌的第二道防线，可以捕获进而杀灭入侵的致病微生物。当构成中性粒细胞细胞外诱捕网的主要结构-DNA被降解破坏后，中性粒细胞几乎丧失了这种胞外杀菌能力。另外研究也发现用抗组蛋白抗体处理后，中性粒细胞的胞外杀菌效能也较之前明显降低。这些结果表明解聚的DNA骨架以及组蛋白是中性粒细胞细胞外诱捕网发挥作用的主要结构。中性粒细胞细胞外诱捕网的颗粒成分有很多，其中包括弹性蛋白酶、组织蛋白酶、髓过氧化物酶、防御素和溶菌酶等，另外乳铁蛋白、抗菌肽LL-37及三级颗粒中的基质金属蛋白酶(MMP-9)等都是组成细胞外诱捕网的重要成分。随着进一步的研究发现除了杀菌之外，这种形成的诱捕网还可以促进凝血或者参与血栓形成。在动物模型中已经发现中性粒细胞释放细胞外诱捕网有助于静脉血栓形成［37-39］。研究证明中性粒细胞细胞外诱捕网可以提供血栓形成所需的环境，并为血栓形成发挥支架作用。中性粒细胞细胞外诱捕网可以捕获血小板和微粒，稳定血栓［40-42］。另外，它还可以通过结合弹性蛋白酶和组织蛋白酶来失活组织因子途径抑制物进而增加组织因子活性［43］。一项研究发现粒细胞集落刺激因子有增强中性粒细胞产生细胞外诱捕网的能力［29］。中性粒细胞细胞外诱捕网中的组蛋白可直接使血小板活化，增加血小板的粘附、聚集作用，使形成血栓更加容易。另外，细胞外诱捕网还可以促进凝血酶依赖性的纤维蛋白生成，并且也可结合到纤连蛋白及纤维蛋白原上，使血液凝固加速，中性粒细胞细胞外诱捕网在静脉系统中可将红细胞招募于血管的损伤处、促进纤维蛋白沉积，进而诱导红色血栓形成。另外，中性粒细胞细胞外诱捕网中的组蛋白还可以使细胞表面的磷脂酰丝氨酸外翻，这些外翻的磷酯酰丝氨酸为凝血酶复合物的组装提供重要的促凝表面，从而促进凝血酶的生成，使可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，促进血液的凝固。也有研究发现组蛋白可以与血小板结合促进钙内流等来参与凝血。通过对慢性粒细胞性白血病小鼠模型研究发现恶性和非恶性的中性粒细胞均更加倾向于释放中性粒细胞细胞外诱捕网。在乳腺癌及肺癌模型中也可以同样观察到对于细胞外诱捕网形成敏感性的增高。这些说明，癌症通过对于宿主细胞系统性的作用，可以诱导外周白细胞的增加，并使其更加容易形成中性粒细胞细胞外诱捕网。另外，在晚期乳腺癌模型中发现，中性粒细胞细胞外诱捕网的形成伴随着肺部静脉血栓的出现。并且，在肿瘤患者中，程度较轻的系统性感染即可以导致大量的染色质释放和促凝状态，而在正常人中则没有这种倾向。这些临床和基础研究一起强烈的说明中性粒细胞和单核细胞有助于癌症相关的血栓形成。细胞外的染色质可以形成细胞外诱捕网作为癌症血栓形成的原因，抑制造血细胞因子或者中性粒细胞细胞外诱捕网可能减少伴有白细胞增多的肿瘤患者的静脉血栓形成的发生。3.2血小板增多与癌症相关血栓形成血小板在血栓形成中的作用早已被大家所熟知，不仅在生理情况下，在各种病理情况下，血小板均可以释放促使血液凝固的物质，在血管破裂处加速形成凝血块。在许多的疾病中血小板对于凝血的重要作用已经被广泛研究。随着时间的推移，越来越多的研究发现在癌症患者中，血小板对于血栓形成也发挥着不可忽视的作用。在癌症患者中，血小板不仅在其动脉血栓形成中占据中心作用，也有助于静脉血栓形成［44,45］。在癌症患者特别是胃肠道、肺、乳腺以及卵巢癌中经常可以观察到血小板增多［6］。有趣的是，与那些低血小板的患者相比，血小板数量高的患者在发展为癌症之前就有较高的静脉血栓栓塞率［46］。类似的结果也可以在癌症患者中看到［47,48］。接受沙利度胺或者来那度胺加上低剂量阿司匹林治疗的多发性骨髓瘤患者，其静脉血栓栓塞发生率减低的程度与使用低分子肝素的效果相当，这说明了在这些患者中血小板对于静脉血栓形成的作用［49,50］。另外，阿司匹林的使用与卵巢癌患者中静脉血栓栓塞减少有关而在乳腺癌中则没有这种关系［51,52］。有许多研究来检测癌症中血小板活化的标记物［42］。一般来说，在癌症患者中这些标记物均增高。但是，只有少量的研究来监测癌症患者中血小板活化标记物是否对于静脉血栓栓塞的发生具有预测作用。最近的研究并没有发现各种血小板活化标记物包括血小板因子4与癌症中静脉血栓栓塞的关系［53］。但是，在一项有关胰腺癌的研究中发现血小板因子4增加可能会使静脉血栓栓塞发生的危险性增加约3倍［54］。这种不同强调了研究个体化癌症类型的重要性。卵巢癌中类癌性血小板增多的机制已经通过小鼠模型进行了研究。研究发现肿瘤源性白介素-6会增加肝脏的促血小板生成素合成及血小板生成［55］，因此，阻断白介素-6-促血小板生成素途径可能减低卵巢癌患者中血小板增多及静脉血栓栓塞的发生。血小板在血栓形成中的作用也已经在小鼠癌症模型中研究。用原位同基因胰腺癌小鼠模型研究发现氯吡格雷可以减少肿瘤源性微粒与血栓形成部位的结合［56］。我们发现组织因子阳性微粒通过凝血酶活化血小板，给小鼠注射外源性的组织因子阳性微粒使血栓形成增加，而氯吡格雷则会抑制这种作用［57］。结合这些临床及基础性研究可以得出在一些癌症患者中，抗血小板药物对于预防静脉血栓形成可能有效［42］。的确，关于阿司匹林在高危及中危癌症患者中对于血小板活化标记物和静脉血栓形成的作用的评估将是一个持续性的临床试验。3.3P选择素与癌症相关的血栓形成P选择素是作为一种糖蛋白，主要存在于血管内皮细胞的Weibe-lPalade小体膜上以及血小板α颗粒膜上，当受到组胺、凝血酶、佛波酯和钙离子载体的刺激后，其可以在质膜上迅速表达，缺氧/再氧化或氧自由基也可诱导其表达。P选择素的主要作用是介导粒细胞以及单核细胞在内皮细胞表面的滚动、粒细胞和单核细胞与血小板的黏附。循环中有高水平可溶性P选择素的癌症患者发生静脉血栓栓塞的几率较高。血小板和内皮细胞表达P选择素［58］。内皮细胞表达的P选择素能够通过招募白细胞来促进静脉血栓栓塞的发生。通过对狒狒的研究发现抑制P选择素会减少静脉血栓形成［59］。最近的研究发现在下腔静脉狭窄的小鼠模型中中性粒细胞的招募主要是由内皮细胞表达的P选择素所作用的［31］。最后，在小鼠胰腺癌模型中发现抑制P选择素可以减少血栓形成的发生［60］。这些研究说明P选择素可以作为一个新的靶点通过减少白细胞的招募及微粒的结合来预防癌症相关的血栓形成。3.4低纤维蛋白溶解和癌症相关的血栓形成纤维蛋白溶解（简称纤溶）主要指血液凝固过程中形成的纤维蛋白被溶解。纤溶是体内重要的抗凝血过程，其可以防止过多的血栓形成从而来维持人类正常的生理过程。参与纤溶过程的一系列化学物质所组成的系统被称为纤溶系统。纤溶酶原激活物抑制物抑制纤维蛋白溶解因此其水平增高与血栓形成相关［61］。有研究发现与正常人相比，发生深静脉血栓形成的患者血栓溶解的时间延长［62］，说明低纤维蛋白溶解是静脉血栓形成的危险因素。另外有研究检测了血栓形成患者和正常人中血栓溶解时间和纤溶途径的不同成分，认为在血栓形成的患者中纤溶酶原激活物抑制物及凝血酶活化的纤溶抑制物的增加可以延长血栓溶解的时间［63］。最后，一项病例对照研究发现，相比于纤溶酶原激活物抑制物抗原，活化的纤溶酶原激活物抑制物是静脉血栓形成更好的预测物［64］。很少有研究来评估癌症相关血栓形成中纤溶系统的作用。一项关于胰腺癌患者的研究发现患者纤溶酶原激活物抑制物抗原和活性增加可能更容易发生静脉血栓形成［65］。另外有研究发现，与正常人相比，神经胶质瘤患者体内纤溶酶原激活物抑制物的水平更高［66］。3.5胰腺癌患者中组织因子阳性微粒和静脉血栓形成人类胰腺肿瘤表达高水平的组织因子，并且这种表达与其组织学分级相关65。一项研究发现肿瘤内组织因子表达与静脉血栓栓塞有关［67］。人类胰腺细胞系也表达高水平的组织因子，释放表达组织因子的微粒［68］。微粒是由激活或是凋亡的多种细胞释放的直径为0．1～1．0μm的膜性物质，微粒表面带有许多特异性抗原，这些抗原来自于各种细胞，可以通过这些特异性细胞抗原用相应的抗体特异性来识别判断活化细胞的来源。微粒可以发挥很多生物学作用，如微粒促进炎症反应、加重血管内皮功能障碍，促进血管生成等，随着研究的进一步深入，许多实验发现其可为凝血酶以及凝血酶原复合物的产生提供额外的磷脂催化表面进而促进凝血的发生［70］。Dvorak团队首先提出肿瘤源性微粒与血栓形成之间的关系［71］。他们认为脱落的囊泡携带促凝活性而促进癌症中凝血系统的激活及纤维蛋白沉积。进一步的研究发现癌症来源的微粒促凝活性主要是由于组织因子的存在［72-74］。许多的癌症细胞表达组织因子并释放表达组织因子的微粒［72］。另外，在许多癌症患者如胰腺、肺、胃肠、乳腺和脑部肿瘤的循环中均可以检测到组织因子阳性微粒的存在，这些可能是由肿瘤细胞释放的［75-77］。目前，关于组织因子阳性微粒与癌性血栓之间关系的研究主要集中于胰腺、头部、结直肠或者肺部肿瘤，因为这些患者静脉血栓栓塞的发生率更高［72］。在这些癌症中均可以检测到组织因子阳性微粒的存在，但是在胰腺癌中微粒表达的组织因子的活性更高［76］，这可能是因为胰腺的内分泌功能为组织因子阳性微粒从肿瘤细胞上进入循环提供了一个运输途径。在胰腺癌中组织因子阳性微粒有助于静脉血栓栓塞的发生并且可以作为评估静脉血栓栓塞危险性的一个有用的标记物。组织因子阳性微粒在别的癌症类型中也可能有助于静脉血栓栓塞，但是目前的研究发现并不充分，尚需进一步不断地研究。结束语白细胞、血小板和微粒都有助于癌症相关的血栓形成。目前的评分系统通过癌症部位、白细胞和血小板数量、化疗方法和生物标记物来识别具有高危静脉血栓栓塞发生率的癌症患者。但是，在恶性肿瘤中新的静脉血栓栓塞标记物的发现驱使癌症特异性评分系统的发展从而提高预测的准确率。常规抗栓药物与减少白细胞、血小板数量、降低组织因子阳性微粒活性及抑制中性粒细胞细胞外诱捕网形成的药物一起可以更好的预防和治疗癌症相关血栓形成。参考文献[1]KhoranaAA,FrancisCW,CulakovaE,KudererNM,LymanGH.Thromboembolismisaleadingcauseofdeathincancerpatientsreceivingoutpatientchemotherapy.JThrombHaemost.2007;5(3):632-634.[2]DiNisioM,FerranteN,FeragalliB,etal.Arterialthrombosisinambulatorycancerpatientstreatedwithchemotherapy.ThrombRes.2011;127(4):382-383.[3]FalangaA,MarchettiM,VignoliA.Coagulationandcancer:biologicalandclinicalaspects.JThrombHaemost.2013;11(2):223-233.[4]TimpJF,BraekkanSK,VersteegHH,CannegieterSC.Epidemiologyofcancerassociatedvenousthrombosis.Blood.2013;122(10):1712-1723.[5]BlomJW,VanderschootJP,OostindierMJ,OsantoS,vanderMeerFJ,RosendaalFR.Incidenceofvenousthrombosisinalargecohortof66,329cancerpatients:resultsofarecordlinkagestudy.JThrombHaemost.2006;4(3):529-535.[6]LevinJ,ConleyCL.ThrombocytosisAssociatedwithMalignantDisease.ArchInternMed.1964;114:497-500.[7]ChewHK,WunT,HarveyD,ZhouH,WhiteRH.Incidenceofvenousthromboembolismanditseffectonsurvivalamongpatientswithcommoncancers.ArchInternMed.2006;166(4):458-464.[8]KhoranaAA,ConnollyGC.Assessingriskofvenousthromboembolisminthepatientwithcancer.JClinOncol.2009;27(29):4839-4847.[9]FalangaA,MarchettiM,RussoL.Venousthromboembolisminthehematologicmalignancies.CurrOpinOncol.2012;24(6):702-710.[10]PaneeshaS,McManusA,AryaR,etal.Frequency,demographicsandrisk(accordingtotumourtypeorsite)ofcancer-associatedthrombosisamongpatientsseenatoutpatientDVTclinics.ThrombHaemost.2010;103(2):338-343.[11]KhoranaAA,KudererNM,CulakovaE,LymanGH,FrancisCW.Developmentandvalidationofapredictivemodelforchemotherapy-associatedthrombosis.Blood.2008;111(10):4902-4907.[12]VersoM,AgnelliG,BarniS,GaspariniG,LaBiancaR.AmodifiedKhoranariskassessmentscoreforvenousthromboembolismincancerpatientsreceivingchemotherapy:theProtechtscore.InternEmergMed.2012;7(3):291-292.[13]AyC,DunklerD,MarosiC,etal.Predictionofvenousthromboembolismincancerpatients.Blood.2010;116(24):5377-5382.[14]vanEsN,DiNisioM,CesarmanG,etal.Comparisonofriskpredictionscoresforvenousthromboembolismincancerpatients:aprospectivecohortstudy.Haematologica.2017.[15]PabingerI,ThalerJ,AyC.Biomarkersforpredictionofvenousthromboembolismincancer.Blood.2013;122(12):2011-2018.[16]AlexanderM,BurburyK.Asystematicreviewofbiomarkersforthepredictionofthromboembolisminlungcancer-Results,practicalissuesandproposedstrategiesforfutureriskpredictionmodels.ThrombRes.2016;148:63-69.[17]KudererNM,LymanGH.Guidelinesfortreatmentandpreventionofvenousthromboembolismamongpatientswithcancer.ThrombRes.2014;133Suppl2:S122-127.[18]KhoranaAA.Cancer-associatedthrombosis:updatesandcontroversies.HematologyAmSocHematolEducProgram.2012;2012:626-630[19]ShoenfeldY,TalA,BerlinerS,PinkhasJ.Leukocytosisinnonhematologicalmalignancies--apossibletumor-associatedmarker.JCancerResClinOncol.1986;111(1):54-58.[20]GrangerJM,KontoyiannisDP.Etiologyandoutcomeofextremeleukocytosisin758nonhematologiccancerpatients:aretrospective,single-institutionstudy.Cancer.2009;115(17):3919-3923.[21]KasugaI,MakinoS,KiyokawaH,KatohH,EbiharaY,OhyashikiK.Tumorrelatedleukocytosisislinkedwithpoorprognosisinpatientswithlungcarcinoma.Cancer.2001;92(9):2399-2405.[22]RukaW,RutkowskiP,KaminskaJ,RysinskaA,SteffenJ.Alterationsofroutinebloodtestsinadultpatientswithsofttissuesarcomas:relationshipstocytokineserumlevelsandprognosticsignific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