何水林版基因工程第四章基因操作过程教学版课件

第四章基因操作过程转化子的筛选和鉴定（检）重组DNA分子的转化和扩增（转、增）DNA的体外重组（切、接）亚克隆：把DNA片段从某一类型的载体无性克隆繁殖支另一类型的载体的过程。理想的酶切位点应当符合下列几个条件位于载体上的酶切位点要尽可能少，最好是单一的酶切位点酶切位点前方要一个较强的启动子选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变外源DNA与载体的连接方法黏性末端连接法平未端连接法人工接头连接法同聚物加尾连接法同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接单酶切位点黏性末端连接法的缺点自身环化双向插入多拷贝插入假阳性双酶切片段的定向克隆的优点外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因的正确转录和表达载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒不同粘性末端的连接2平末端的连接从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM3人工接头连接法人工接头又称衔接物、适配子，是人工合成的具有一个或多个限制性内切酶识别和切割序列的双平端DNA短序列，其分子长度约为8－12bp。粘性末端的更换4同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接法同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段。但方法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用人工粘性末端的连接3′突出末端人工粘性末端的连接平头末端同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法主要优点不易自身环化连接效率较高同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化载体和外源片段的末端是互补的粘性末端是一种通用的体外重组的方法用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：

提高重组率的方法加装同聚尾末端：1.1受体细胞应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外

1.2各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）

与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢植物细胞（拟南芥、烟叶）

农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用遗传操作繁琐拟南芥（Arabidopsisthaliana）总状花序顶生花瓣4片，白色，匙形十字花科，二年生草本，高7～40cm，植株小、每代时间短、结子多、生活力强拟南芥是进行遗传学研究的好材料被科学家誉为“植物中的果蝇”拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万bp拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型1.3实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654

酵母菌哺乳动物细胞CHO毕赤酵母（Pichiapastoris）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae

）克隆与导入方法：转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌细胞遗传性状发生改变转染：携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法电转化：受体细胞施加短暂的高压电流，其质膜上形成微孔，外源DNA通过微孔进入宿主细胞基因枪法：利用压缩气体动力，产生的冷气体冲击波进入轰击室，把粘有DNA的金粉打向细胞核。微注射法：将外源基因直接注射到真核受体细胞内转化酵母菌植物细胞的叶盘法基因转移2重组DNA导入受体细胞的方法2.1转化（transformation）感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如E.coli等）①Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化1970年建立此技术，原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态(competent)转化子（transforment）：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。pUC18质粒实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时实验步骤菌株活化挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.41个OD600约含E.coli109个/mL加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2，悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油可－70℃长期保存感受态细胞制备:将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min4℃4000rpm离心5min，弃上清加入0.8ml预冷的0.1mol/LCaCl2，悬浮沉淀，冰上预冷10min4000rpm离心5min，弃上清外源DNA的转化取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min42℃水浴90S（切勿摇晃！）冰上放置2min加入800μlLB液体培养基37℃水浴复苏50min37℃培养9～16h铺200μl于含X-gal，IPTG，Amp的LB平板（含100μg/mLAmp，表面均匀涂有16μL50mg/mL的X-gal和4μL200mg/mL的IPTG混合液）利用成品感受态细菌转化在Selektionsplatten(LB/Amp/IPTG/X-Gal)

上生长的是转化子非重组子重组子同时做两个对照:以同体积的无菌双蒸水代替重组质粒DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现阴性对照感受态细胞被有抗生素抗性菌株污染，可长出菌落选择性平板失效，可长出菌落选择性平板被有抗生素抗性菌株污染，可在平板边缘或中间长出菌落以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落阳性对照

②电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验将细菌溶于1～2ml10%的甘油中，以40～80μl/管分装-70℃冻存，备用挑一个DH10B的单菌落接种于5ml液体LB中，过夜培养1/100×接种后37℃，220转/min，摇菌2～３h(OD500达0.7左右)6000rpm,4℃离心15min,收集菌体，以下均需在冰上操作用等体积的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集用1/2×的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集加入20～30ml10%的灭菌甘油洗细菌沉淀，离心收集将脉冲电击转化仪打开，调电压为1.8KV从-70℃取出保存的感受态细胞，解冻后置于冰上每管感受态细胞加入1μl连接产物,转移到电击杯中电击，然后迅速向电击杯中加入1ml液体LB培养基将电击后的菌液转移至1.5mlEppendorf管，37℃恒温摇床培养1h铺100μl于含X-gal和IPTG的Amp平板37℃恒温培养箱培养9－16h2510电转仪，适用于原核细胞适用于真核细胞电转化及原生质体融合Invitropackagingandtransfection2.2转染（transfection）

l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：

将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：

加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟转染裂解：

加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选3转化率转化率是衡量转化效率的重要指标转化率：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：

每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）如：pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4×1011个分子（6.02×1017

/2686×660），即每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2×1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，

经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：

104/107X10-2=0.1mg载体DNA

考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：

0.1/20%=0.5

mg载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA

转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA

原生质体转化109

个原生质体 50ngDNA

原生质体转化105-106/mgDNA

l-DNA转染107-108/mgDNA

电穿孔转化106-109/mgDNA

4转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定扩增操作

转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程λ噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作第三节重组子的筛选“选择”（selection）和“筛选”（screening）的基本含义

选择：是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法

筛选：是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程简单选择：根据克隆载体提供的表型特征的选择直接选择：根据突变的互补作用对克隆基因的选择由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子物理检测法核酸杂交法免疫化学法遗传检测法重组子的筛选方法主要有DNA测序检测法1遗传检测法插入失活选择法（Tetr等)显色互补选择法（LacZ′）抗药性标记(Ampr、Tetr等)插入表达选择法（CⅠ阻碍蛋白失活，CⅠ表达）利用报告基因选择法（GUS、Gfp、NTPⅡ、LUC、TK等）1.1根据选择性标记筛选转化子抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗药性筛选法的基本原理：pBR3224363bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Amp的平板再将Amp平板上的转化子影印至含有Amp和Tet的平板上

在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为

ApAp+Tc影印挑选重组子

显色筛选法显色筛选法的基本操作：pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ′标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落

1.2营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

常见的营养缺陷型筛选标记：哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶2依赖重组子结构特征的筛选法①凝胶电泳法带有插人片段的重组体在相对分子质量上会有所增加分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。但电泳法不能鉴别插入片段是大小相近的非目的基因片段②限制性酶切图谱法对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本高3核酸杂交法从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术分子杂交(molecularhybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子之间杂交根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。3.1探针及制备在分子杂交来检测中，一段带有标记的与目标核酸分子序列同源的互补核酸片段称为探针（probe）

探针的类型寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针单链DNA探针寡核苷酸探针（oligonucleotidprobe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。常用寡核苷酸探针的标记物放射性同位素标记：32P、33P、35S非放射性标记：生物素、地高辛生物素－dUTP、生物素－dATP、地高辛－dUTP等杂交探针的标记：ABC荧光标记杂交探针的标记：ABC显色酶标记地高辛－dUTP杂交探针的标记：地高辛系统标记两种地高辛－dUTP显色系统DIG探针杂交过程杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）

足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区

探针的制备方法或来源包括：人工合成cDNA合成

同源序列mRNA

GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAT4-PNP介导的末端标记探针的标记方法切口移位(平移)法引物延伸法末端标记法体外转录或反录法①末端标记TdT介导的末端标记T4-Pol介导的末端标记②

DNA聚合酶介导的切口平移标记③

DNA聚合酶介导的随机引物法④逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）5’TTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA转录酶介导的转录标记3.2原位杂交(insituhybridization)菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的温育，保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签①0.5MNaOH裂解细菌②酸中和③蛋白酶处理④漂洗细胞碎片⑤80℃烘烤与32P-标记的探针杂交放射性自显影在参照平板上挑取目标阳性克隆（阳性菌落）扩大培养菌落原位杂交噬菌斑原位杂交3.3Southern杂交(Southernblotting)目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳①0.4NNaOH变性②1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）中和③使DNA仍保持单链状态①将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上②通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上

洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去检测：放射性标记、检测非放射性标记、检测分子杂交炉紫外交联仪M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（λDNA/HindⅢ）1-3，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnⅠ-PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切以cry1Aa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG标记探针3.4Northern杂交(Northernblotting)(A)RNAisisolatedfromvarioustissuesandisseparatedbysizeusinggelelectrophoresis.(B)Thegelisthenplacedonapaperwick,whichabsorbsanionicsolutionfromatrough(C)AfilterthattrapsRNAisplacedabovethegel,andblottingpaperisplacedabovethefilter.Capillaryactiondrawsthesolutionthroughthegel,trappingtheRNAonthefilter(D)Thefilterisincubatedwithradioactivesingle-strandedDNAcomplementarytothemRNAofinterest(E)AfteranyunboundDNAiswashedoff,autoradiographylocalizesthemRNAinthesamplesthatcontainit.(F)DrawingofadevelopmentalNorthernblotshowingthepresenceofPax6mRNAintheeye,brain,andpancreasofamammalianembryo双脱氧法测序

(Sangerdideoxyprocedure

)4DNA序列的测定(Sangerdideoxyprocedure

)大规模测序的策略和测序技术的发展化学法测序(Maxam-Gilbertprocedure)

FrederickSangerDNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′-磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。4.1双脱氧法测序

(Sangerdideoxyprocedure

)①双脱氧法测序

原理双脱氧法测序基本过程自动测序电泳装置AnexampleofaportionofachromatogramfromautomatedsequencingAutomatedsequencingisbasedonthedideoxymethodology,butfourdifferentfluorescentdye-labelledddNTPsareused.Thuseachfluorescentlabelcanbedetectedbyitscharacteristicspectrum.Theproductsareseparatedbyautomatedelectrophoresisandthebandsdetectedbyfluorescencespectroscopy.Sanger测序仪采用96个毛细电泳管的阵列，可以同时进行96个这样的测序反应，每个反应得到的Read长度可以达到1000bp以上

MEGABACE1000DNA测序仪多道移液器96孔反应板②双脱氧法测序

程序将待测基因序列打断成较短重叠的DNA片段群DNA片段连入载体，在E.coli体内扩增，挑取单菌落，分离纯化重组载体测序加入DNA聚合酶，dNTP以及带有荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP凝胶电泳，检测标记过的核苷酸片段的荧光信号。根据重叠序列，通过软件处理，DNA序列信息测序载体pUC：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所不同，但基本均由pUC衍生而来，使用时需先变性M13系列和pUC系列的测序载体的使用避免了使用物理方法分离大量的DNAM13：单链噬菌体载体，目前很少采用测序DNA聚合酶①DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′的聚合酶活性，3′→5′的外切酶活性持续合成能力不强，不能复制富含二级结构的模板区以ddNTP为底物的能力远比在dNTP低易受DNA制备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效②T7噬菌体聚合酶(测序酶)是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，缺乏3′→5′外切酶活性能产生出非常漂亮的DNA梯带，每条带都具有相似的强度，可读的DNA序列可覆盖凝胶的全长测序酶催化ddNTP结合的速率是dNTP的33%具有1.0和2.0两个版本，2.0取代了1.0，能对折叠成二级结构的模板起作用测序酶526位氨基酸为Tyr，若换成Phe，结合ddNTP的能力下降2000倍，将E.coliDNAPolⅠ或TaqdnaPol类似氨基酸换面Tyr其结合ddNTP的能力提高8000倍③TaqDNA聚合酶它在高温下（70℃）进行终止链反应的能力可减少测序反应中由于模板DNA上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部到底部条带逐渐减弱，出现阴影。可用于富含二级结构的模板催化ddNTP结合的与该区模板DNA序列的影响TaqDNAPol和PfuPol催化ddNTP结合的速率比结合dNTP的速率低两个数量级通用引物的使用避免了合成不同引物的麻烦（M13正反向，T7，SP6等）M13Primers（TaKaRa公司）M13Primer各引物位置图形态冻结干燥品。可用灭菌水或TEBuffer(pH7.5～8.0)溶解后使用用途作为具有SP6Promoter载体的测序用引物或PCR用引物4.2化学法测序(Maxam-Gilbertprocedure)

经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，根据X光片所显现的相应条带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序是一个DNA化学降解的过程，而不是生物合成过程化学试剂处理具有末端标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物注意：只能标记一个碱基，多碱基标记会产生错误。标记方式：羟基磷酸化反应、大肠杆菌聚合酶IKlenow片段及[α-32P]dNTP标记、用末端转移酶标记DNA片段的3′端

G系统；pH8.0硫酸二甲酯→G→m7G→C8~N9断裂→脱G

A+G系统；pH2.0哌啶甲酸（pidine）→嘌呤环N质子化→脱嘌呤C系统；1.5mol/LNaCl（高盐）C+肼（hydrazine）→脱C

T+C系统（非高盐条件）肼(hydrazine)→打开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶化学降解法测序基本过程生物信息分析学会利用丰富的网上资源！普通的序列分析软件序列的拼装：CAP（contigassemblingprogramme）同源性的比较：BLAST，ClustalW等。集成软件：如BioEdit等提供如少数序列的拼装，同源性的比较，开放阅读框的查找，酶切位点的查找等功能。PCR技术与发展简史PCR技术基本原理和操作PCR的发展与应用5PCR扩增法3.1PCR技术发展简史聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法AppliedBiosystemsGeneAmpPCR9700ThermocyclerDr.HargobindKhorana（1922－）Khorana(1971)等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。序列分析方法未成熟寡核苷酸引物合成还处于手工及半自动合成阶段热稳定的DNA聚合酶未见报道因此这个想法没有实际意义！！但是：TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1968"fortheirinterpretationofthegeneticcodeanditsfunctioninproteinsynthesis"加速分子生物学发展进程的一项“简单而晚熟”技术TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis1944－Dr.MullisjoinedtheCetusCorp.inEmeryville,California,asaDNAchemistin19791983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。Mullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段Klenow片段不耐热，每个循环加一次酶是一个笨拙的中看不中用的实验室方法扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段1988年Keohanog改用T4DNAPol但仍是每个循环加一次酶1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.(1988)Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.239:487-491.

SaikiRK,ScharfS,FaloonaF,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.(1985)Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysesfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.230:1350-1354.3.2PCR技术基本原理和操作类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物基本反应步骤变性退火延伸变性3.2.1PCR技术基本原理①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5min模板DNAdNTP引物BufferTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer94℃

30s55℃1min72℃2.5minTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃7～10min循环25～35次第二轮扩增第三轮扩增第一轮扩增产物目的基因目的基因琼脂糖凝胶电泳PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用下面的公式计算。PCR反应动力学Y＝(1＋X)nY：代表DNA片段扩增后的拷贝数X：表示平均每次的扩增效率n：代表循环次数平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应3.2.2PCR技术反应体系、条件和过程引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液①PCR反应的基本成分10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul标准的PCR反应体系：ddH2O11μLcDNA第一链模板1μL2×GCbuffer25μLdNTP(25mmol/L)8μLP7(10μmol/L)2μLP8(10μmol/L)2μLLATaqDNApolymease1μL在0.1mL离心管中加入下列溶液:总体积50μL

RT-PCR

②10×扩增缓冲液KCl500mmol.L-1Tris-HCl100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl15mmol.L-1明胶0.1%在延伸温度（72℃）下，pH值接近7.2，二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用1.5mMMg2+，有时使用Mn2+。dNTP都能结合Mg2+，因此Mg2+的浓度要大于dNTP，KCl对扩增大于500bp长度和改善DNA片段产物是有益的标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP（终浓度：250µmol/L）③dNTP④酶及其浓度SelectionforDNApolymeraseKlenow酶，早期采用，该酶不耐热，缺点有①温度要求低(37℃)，受热即失活；②产物特异性不高；③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；④扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）thermostableDNApolymerases①TaqDNApolymerase②TthDNApolymerase—fromT.thermophilus③VENTDNApolymerase—fromT.litoralis④Sacpolymerase⑤pfupolymeraseTaqDNA聚合酶分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感，最适浓度为50mmol/L。忠实性：没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意抑制剂：尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂内源DNA：不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存：在-20℃至少6个月。如何选择最合适的DNA聚合酶

－－PCR实验的不同需求特异性：基因组扩增、RT-PCR保真性：基因筛选、测序、TA克隆长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测热启动Taq酶特点：3′→5′核酸外切酶活性，降低碱基错配率用途：表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）高保真酶Promega中国公司普洛麦格（北京）生物技术有限公司产品高保真＋高扩增效率混合酶－热启动耐热聚合酶－3′→5′核酸外切酶用途超长片段扩增、测序构建基因图谱复杂模板扩增：GC含量高、二级结构-controlledtemperature

-controlledrateoftemperaturechangeThermocyclerGradient-Thermocycleranautomaticmachine,acomputer-controlledthermalblock,inwhichthetemperaturecanberapidlychangedandfinelycontrolled引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。⑤引物Ⅰ设计引物的原则引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3′端的碱基要求严格配对

特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会引物的解链温度两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃

Ⅱ简并引物设计（degenerateprimers)如：AsnPheTyrAla对应的核苷酸序列(?)AAUUUUUAUGCUAACUUCUACGCC等N/ATCGⅢ设计引物的方法设计引物的操作流程同源性比较序列下载引物设计筛选根据所需要检测的基因在查询有关序列利用primerpremier5.0等软件进行设计和筛选同源性比较中在线比较采用OMIGA，PGCENE进行两两比较或