感受态细胞和质粒的转化

感受态细胞和质粒的转化第1页，共37页，2023年，2月20日，星期五导入大肠杆菌:

氯化钙转化法electroporation

电击法又叫电穿孔法体外包装感染法重组DNA导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导法、原生质体融合法

酵母菌转化法:

完整细胞转化法原生质体转化法电击法

第2页，共37页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌(Escherichiacoli)大肠杆菌(Escherichiacoli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和期)，约1×109~2×108/mL和衰老期。第3页，共37页，2023年，2月20日，星期五第4页，共37页，2023年，2月20日，星期五

大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2.菌株的保存第5页，共37页，2023年，2月20日，星期五①LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。

E.coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中，4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。②穿刺琼脂(stabagar)，室温，避光可保存数年。③冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20～

-70℃。可经过30次冻融，细菌仍然存活。菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。具体保存方法：第6页，共37页，2023年，2月20日，星期五琼脂穿刺培养基2×冰冻培养基琼脂（Difco）6gK2HPO4

12.6g细菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-柠檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO4

1.8gddH2O至1LKH2PO4

3.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制第7页，共37页，2023年，2月20日，星期五高压灭菌 Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helperphage -4℃ 置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次 第8页，共37页，2023年，2月20日，星期五抗生素工作浓度松驰型质粒严紧型质粒

氨苄青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL

氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL

卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL

链霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL

四环素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制第9页，共37页，2023年，2月20日，星期五大肠杆菌感受态细胞制备和贮存

在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。第10页，共37页，2023年，2月20日，星期五感受态细胞(Compenentcells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。(主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)①取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜(一般16小时)。②取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振培养，过夜(8~16小时)。③取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)，OD550达0.3~0.5。注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。

HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL）

X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）第11页，共37页，2023年，2月20日，星期五④细菌培养管取出置水浴中，10~15分钟。⑤细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。⑦4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。⑧用预冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。可直接使用。⑨次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。⑩分装成每Eppendorf管200uL。

新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。第12页，共37页，2023年，2月20日，星期五①

CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。②

CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长对数期的后期。两种假设：第13页，共37页，2023年，2月20日，星期五5.DNA转化感受态细胞

抗生素

抽滤除菌并均置

-20℃保存。抗生素不耐热，在加入到琼脂板中时，应等琼脂冷至48~50℃时再加入抗生素

Mg++是四环素拮抗物，需加MgCl2时改加NaCl(6g/L)

四环素光敏感应避光保存（1）抗性琼脂板中抗生素的配制第14页，共37页，2023年，2月20日，星期五①感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。②取出分装到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分钟。⑤37℃或42℃水浴2分钟。(热休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培养基，37℃振荡培养1小时。⑧取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB则全部铺板。（2）转化步骤第15页，共37页，2023年，2月20日，星期五⑨取100~200uL，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；静置5~10分钟。⑩倒置37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。

并设下列对照：A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。

DNA超螺旋转化最好

DNA环状次之

DNA线状有干扰作用

1ugpBR322DNA转化入HB101可得：5×106/2×107转化子。

DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高限为15kb。一般1ugDNA可得5×107~1×108个转化菌。第16页，共37页，2023年，2月20日，星期五（3）注意事项①宿主菌取出时应注意菌株名及编号。②检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。③整个操作过程应保持无菌状态。④LB培养液中不能有抗生素。⑤不同受体菌，培养要求不同。如K802株，OD550=0.5

最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。

质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。第17页，共37页，2023年，2月20日，星期五（4）质粒的三种构型①超螺旋闭合环状DNA，cccDNA。②开环DNA，至少一股DNA上有缺口，一处或多处使DNA鲜旋。③线状DNA

琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分开，Agrose电泳中cccDNA位置最前。第18页，共37页，2023年，2月20日，星期五二、阅读微生物的基因型符号

在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。

1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因(如trp)时，可以用trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示lon基因的缺失突变。第19页，共37页，2023年，2月20日，星期五2．有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子F。细菌中有F因子的描述为F+；没有的为F-。有些F因子上面带有细菌的某些基因，这样的F因子写作Fˊ，它所带基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面带有细菌的lac和proA，B基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示F因子上面带有lac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。

3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现型则应该写为Sup-。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写为sup-或者sup，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如Sul；但是，它的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如supD和supE等。第20页，共37页，2023年，2月20日，星期五JM83，F-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ△M15是这样一个品系：不带F因子，ara基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖)，lac操纵子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖体的S12亚基突变(因此有链霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有α-互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组DNA转化入这个细菌，就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子)。野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的DNA分子，上面有约2800个基因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。试举一例来说明上述概念：第21页，共37页，2023年，2月20日，星期五

通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在野生的基因型上加“+”，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个大写字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“△”表示，如“从lac到proAB基因缺失时表示为△(lac-proAB)。野生的大肠杆菌本来还有具有F因子等的质粒DNA，并且感染噬菌体。把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体(Prophage)，例如e14。一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或“/”等加以区别表示。第22页，共37页，2023年，2月20日，星期五表现型是用罗马字母体表示(第一个字母大写)。一般通过变异而获得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)。基因型表现容易混淆，使用时注意。*基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株来源的大肠杆菌。*大肠杆菌B株原来就为lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。第23页，共37页，2023年，2月20日，星期五supE(suppressor)抑制基因

supE变异时，即使存在终止密码UAG，此处也会插入谷氨酰胺(Glutamine)，从而可使蛋白质继续合成。

supF(suppressor)抑制基因

supF变异时，即使存在终止密码子UAG，此处也会插入酪氨酸(Tyrosine)，从而可使蛋白质继续合成。停止密码回复第24页，共37页，2023年，2月20日，星期五recA(recombination)重组相同的DNA重组活性缺失由于导入DNA与宿主DNA的重组受到阻害，可以保持插入DNA的稳定性。与recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能够使插入DNA稳定存在。

recB，C(recombination)重组内切核酸酶V变异。抑制重组并能影响放射线损伤的修复。

traD(transmissibility)遗传稳定性在质粒F因子内部，与大肠杆菌的结合有关。

TraD变异后，F因子自身的传递能力显著下降。重组机能缺失第25页，共37页，2023年，2月20日，星期五dam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌来源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失

dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌来源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失

hsdR(hostspecificitydefective)宿主特异性缺陷宿主菌来源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切断部位蛋白变异转化的外源DNA不被限制酶EcoK切断，可以进行克隆

hsdM(hostspecificitydefective)

宿主菌来源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白变异

hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌来源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的识别部位蛋白变变异转化的外源DNA不被限制酶EocK切断，可以进行克隆对插入DNA具有直接作用因子的缺失第26页，共37页，2023年，2月20日，星期五

endA(endonuclease)内切核酸酶宿主菌来源的非特异性内切核酸酶I活性缺失，可以提高纯化的质粒DNA的质量。

NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。

mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。

mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。第27页，共37页，2023年，2月20日，星期五

rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)

由30S核糖体蛋白变异而获得链霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。

gyrA(gyrase)

由DNA回旋酶亚基A的变异而获得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。

Tn5(transposon)

转座子变异，获得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。

Tn10(transposon)

转座子变异，获得四环素（Tetracycline）抗性（Tetr）。抗药性的变异第28页，共37页，2023年，2月20日，星期五lon(longform)

分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌B株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。

omp(outermembraneprotein)外膜蛋白膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分解。宿主蛋白酶缺失第29页，共37页，2023年，2月20日，星期五lacIq(lactose)

乳糖操纵子中控制β-半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于lacIq变异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的转录过程完全受到抑制。

lacZ(lactose)β-半乳糖苷酶活性缺失

lacZ△M15β-半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表达。当与多数载体质粒中所具有的α-fragment共同存在时，可使β-半乳糖苷酶的活性回复(α-互补性)。在含有X-gal的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组体。

deoRdeoR变异，可以选择性地改善大分子DNA的转化。有利于选择转化体的基因第30页，共37页，2023年，2月20日，星期五

dut(dUTPase)dUTP酶

dUTP分解酶活性缺失，当dUTP分解酶存在时，dUTP不能掺入到DNA链中。

ung(Urasil-N-glycosylase)尿嘧淀-N-糖苷酶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。当具有这种基因时，可以特异性地分解DNA含U的那条链。

mutS(mutator)突变子未被甲基化的新合成DNA链的错配序列修复受到阻碍。有利于点突变的基因第31页，共37页，2023年，2月20日，星期五

leuB(leucine)亮氨酸在最小培养基中必须添加亮氨酸(Leu)proAB(proline)脯氨酸脯氨酸代谢基因变异。在最小培养基中只有添加脯氨酸才能生长。用于确认JM109等大肠杆菌菌株的F因子是否脱落。

Thi-1(thiamine)硫胺素

硫胺素代谢基因变异，在最小培养基中必须添加硫胺素。菌株筛选用基因第32页，共37页，2023年，2月20日，星期五

LacZ、lac5、

trpE、bio、bio256从大肠杆菌lac、trp和bio区置换而来

imm80、QSR80从φ80噬体置换而来

imm434从φ434噬菌体置换而来

imm21从φ21噬菌体置而来

int29从φ29噬菌体置换而来

b2、b1007、b527、b189B域的缺失突变，使att位点受破坏并因而阻止溶源化

KH52φ80噬菌体DNA的缺失突变

KH53类似于λ噬菌体cI区域的φ80噬菌体区域的缺失突变，可有效地防止溶源化

KH54Rex－cI区域的缺失突变，可有效地防止溶源化

nin5转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并且也删除了ral基因附近的BamHI位点

ninL44转录终止位点tR2的缺失突变，可使延迟早期转录不依赖于N基因产物，并且也删除了ral基因附近的BamHI位点。

WL113从33240位的SalI到34500位的BamHI之间的1，3kb缺失突变，不损伤gam基因，但kil，cⅢ、ssb和ral基因被删除。

sslIλ1-2从第一到第二个SalI之间的0.5kb缺失突变，gam基因和部分bet基因被删除。第33页，共37页，2023年，2月20日，星期五续上表shndⅢλ2-3λ噬菌体第二与第三个HindⅢ之间的2.3kb缺失突变，部分b区被删除sxIλ1oXbaI酶切后经外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突变

鼠填充片段大肠杆菌填充片段

lac操纵基因+

腺病毒DNA在重组体中将被置换的载体DNA片段BluescriptM13-重组入λZAP载体的噬菌粒，当用M13辅助噬菌体感染后，噬菌粒部分可在体内被切下。lacY、lacZ、lacPO

、lacIq、ampr插入ΛOPF8的lac和氨苄青霉素抗生基因Aam、Bam、Eam、

Wam、gamam可被supE和（或）supF抑制的琥珀突变。intamInt基因内的BamHI位点被消除后形成的琥珀突变。Sam7、Sam100参与溶解细菌细胞膜的一个基因内的琥珀突变。该突变可被supF抑制，但不被supE抑制，失却野生型S基因产物后，引起感染性噬菌体颗粒在细胞内发生积累。cIts857使cI基因产物对热不稳定的温度敏感突变chi促进λ噬菌体定向重组的特定八核苷酸序列gamGam基因编码大肠杆菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型DNA复制有效地转向滚环复制。Gam基因产物对于λ噬菌体有recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌体溶源的recA+菌株（Spi表型）内的生长非常重要。exobet(red)Exo和bet是位于λ噬菌体red区域的两个基因（red表示两个基因或任一个基因）。这两处基因产物参与当从Q型DNA复制向滚环复制转变时的重组过程。这两个基因产物对于λ噬菌体在recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌体溶源的recA+菌株（Spi表型）内的生长非常重要。第34页，共37页，2023年，2月20日，星期五常用细菌菌株C600F-thi-1thrleuB6lacY1ton21supE44λ-常用于制备裂解物及增殖λgt10的抑制型菌株

该菌株也叫CR34C600:HflA150(Y1073)F-thi-1thrleuB6lacY1tonA21supE44λ-hflA150(chr:Tn10)·hostforrepressingbackgroundplaquesofλgt10whenestablishingcDNAlibrariesDH5F-endA1recA1hsdR17(rk-mk+)λdeoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpBR322orothernon-Pucvectors·usefulforcDNAcloningDH5αF-φ80dlacZ△M15(lacZYA-argF)U169endA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforcDNAcloningDH5αFˊFˊ-φ80dlacZ△(lacZYA-argF)U169endA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gryA96relA1·HostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectors第35页，共37页，2023年，2月20日，星期五续上表DH5αFˊIQFˊproAB+lacIqZ△M15zzf::Tn5[Kmr]/φ80dlacZ△M15△(lacZYA-ARGf)U169andA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostofrexpressionfromthelacpromother·hostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectorsDH5α-MCRF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△(lacZYA-argF)U169endA1recA1deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresiduesDH10BF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-·hostforpUCandot