遗传学医用5课件

Chapter9基因操作

（第一节、重组DNA技术基因工程第二节、基因文库第三节、分子杂交及相关技术第四节、DNA多态1第九章重点内容提示基因操作，重组DNA技术,原理,步骤限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端，粘末端）基因载体（vector）,条件，常用载体基因探针，来源克隆(clone)探针标记方法:nicktranslation(缺口平移)、随机引物法DNA多态，RFLP，VNTR，STR，微卫星DNAPCR方法、原理、应用Southern–Blot:方法、原理、应用Northern-Blot：方法、原理、应用2

Chapter9基因操作

70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。3

第一节

重组DNA技术基因工程

重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。

5

一、限制酶

限制性内切核酸酶(restrictiveendonucle-ases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”）发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。61、限制酶的命名

根据其来源命名。如：

属名

菌株名

EcoRI

种名

编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。795’－CTGCAG－3’3’－GACGTC－5’5’－GGATCC－3’3’－CCTAGG－5’5’－GATC－3’3’－CTAG－5’5’－GG3’－CCCC－3’GG－5’5’－GGCC－3’3’－CCGG－5’HaeⅢMboⅠBamHⅠPstⅠ5’－3’－CTAG－5’5’－GATC－3’－5’5’－G3’－C

CTAG

－5’5’－GATC

C－3’G－5’5’－CTGCA－3’3’－GG－3’3’－ACGTC－5’限制性内切核酸酶10互补末端连接11产生相同序列的突出末端的不同片段

可有三种方式：

1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。133、特点：

根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。14二、基因运载体及其选择

载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。15（一）质粒plasmid

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

PBR322大肠杆菌pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革兰氏阴性菌pc194scp12真核生物-酵母质粒

17常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC1918

（二）.λ-噬菌体(λphage)是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装37~52kbDNA分子.改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：19裂解途径21（三）.粘粒(cosmidvector)（30~50kb）

是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30~50kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

22(四)大片段DNA克隆载体

人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。232、噬菌体PI载体和PAC

PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110~115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统PAC。253、酵母人工染色体

（yeastartificialchromosome,YAC）适用于克隆大片段DNA，0.2~2Mb。26三、DNA重组与分子克隆化

为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。29

基本原理与过程：

1、构建重组DNA：分离纯化目的基因目的基因+vector=重组DNA分子2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。

3、细胞克隆的筛选:筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone），将转化的细胞至于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。

30分离纯化目的基因

目的基因+vector=重组DNA分子

31vectorrestrictionendonuclease重组DNA技术流程简图foreignDNAbacterialcell32ligase重组DNA技术流程简图vectorrestrictionendonucleaseforeignDNAbacterialcellhost33重组DNA

和分子克隆

34重组DNA和分子克隆的几种方法：

1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆；2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆35筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone）

36筛查含有目的基因的细胞克隆37从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

3839四、目的基因表达

上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。

重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。就是将目的基因与表达载体重组(含激动子)，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆（expressioncloning）.40目

的

基

因

表

达

41（一）．真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达

原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列）；2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。

产物特征：1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；2）活性受限或无活性。42(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达

真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。43第二节、基因文库

基因文库（genelibrary）应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的克隆。44一、构建基因组DNA

文库45

ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophageλvector

46二、染色体特异的基因文库

（chromosomespecificlibrary）

单个染色体:

细胞克隆

（流式C仪）↓细胞

染色体染色体文库

染色体区带:

区带特异（显微切割）↓

DNA文库

47

三、cDNA文库（cDNAlibrary）

cDNA文库构建：

特定组织细胞一定发育阶段

总mRNA48第三节

分子杂交及相关技术

分子杂交（molecularhybridization）,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。

分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。

49分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。

双链probe或DNA解链，主要取决于：1．链的长度：链越长，需要的能量多才能解链；2．碱基成分：GC含量高，较难变性；3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链50一、基因探针（geneprobe）是指与一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。DNA探针(DNAprobe)RNA探针(RNAprobe)寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)单一EST探针(uniqueESTprobe)51（一）.探针的种类与制备

1、基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆

扩增

大量的DNA探针52DNA克隆532、cDNAprobe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。

543、寡核苷酸probe:

克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。根据已知基因序列合成一段互补的DNA片段。一般长约15~50个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。

55（二）探针的标记

将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。

常用于标记探针的标识物：同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。

常用的标记方法：561、缺口平移法（NickTranslation）原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’3’外切酶活性，在缺口处按5’3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。

57NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP582、随机引物法（6核苷酸引物标记法）

原理及过程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。59随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓603、DNA末端标记61二、DNA杂交常用的方法

（一）.Southernblot

1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。

1、原理和步骤:提取T、CellDNA限制酶消化DNA片段电泳分离变性转移至尼龙膜变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析62SouthernBlot63-+Southernblot探针642、应用:

(1).基因组结构分析：

如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析65(二).斑点杂交(dotandslothybridization)

鉴定核酸序列的简便方法。1、原理及步骤：提取T、CellDNA↓点样品至膜、干燥、固定↓探针、DNA变性、杂交↓洗膜、放射自显影↓结果分析

66DNA

样品

2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析

点样Probe-32P检测AB123467（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleatide,ASO）

该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针5’-AGT-3’与正常基因序列杂交稳定；

突变探针5’-AAT-3’与突变基因序列杂交稳定；PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物——突变基因检测。68例:PKU产前诊断正常探针突变探针12ⅠⅡ12Ⅱ2进行产前基因诊断结果分析Ⅱ2为正常个体69三、Northernblot

是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。1.原理及步骤：提取T、Cell总RNA↓提纯分离mRNA↓琼脂糖凝胶电泳分离RNA↓转移至硝酸纤维素膜↓杂交检测70NortherBlot71

2、应用：

（1）检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）

72四、Westernblot

是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤Torcell提取蛋白

聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白

（SDS)转移（印迹）于硝酸纤维素膜

加抗体检测某种特异性蛋白质73WestBlot74Westernblot生物素HRP化学显色复合物ABC复合物组织抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗HRP75五、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。KaryB.Mullis7677PCR78ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA79原理：1)合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；2)反应体系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反应程序：

变性(94~95oC)

复性

延伸(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA扩增100万倍80PCR扩增81PCR特点及应用：优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；

（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；

（2）遗传物质的鉴定；

（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息；

（2）产物短小，DNA复制不精确。82PCR相关技术：

1）增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：

一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。832)巢式PCR（nestPCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。84在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3)多重PCR

854）RT-PCR

RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng~μg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。86RT-PCR87RT-PCRcDNA88六、单链构象多态性（SingleStrand

ConformationPolymorphism,SSCP）

是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。89PCR-SSCP过程：

primer

32P-dNTP掺入PCR扩增产物

变性

单链DNA

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

12345自显影1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子

.

解链构像DAN原理过程90PCR-SSCP过程91七、DNA测序（Sequencing）Sanger法9293949596第三节

DNA多态

DNA多态（DNAPolymorphism）：DNA区域中等位基因(或片段)存在两种或两种以上形式,对基因没有影响,称为DNA多态。群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100~500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

常用做遗传分析中的标记遗传标记97DNA分析中常用的多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。98一、序列多态（或点多态）限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。