实验碱性磷酸酶米氏常数的测定课件

实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定

一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1．原理（3）比较吸光度的比值

纯DNA（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度2．常用方法 （1）标准曲线法

OD或Ａ

浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-[S]曲线

v

[S]推导出米氏方程为：其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数

米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。

测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线1/v1/Vm

-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

无色黄色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。

四、分光光度计的使用

1．722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长返回返回返回(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度[S](mM)0.50.751.01.5

310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37℃，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液反应时间37℃，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液OD405（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。六、注意事项取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。空白对照一定要先加NaOH，后加酶。测定OD405时要以各自的空白调零点。移液管或取液器的使用比色杯的使用管号11'22'33'44'55'

加酶时间（min）0.511.522.533.544.55加NaOH时间10.51111.51212.51313.