实验多抗制备4免疫比浊课件

沉淀反应本次实验内容实验一、双向免疫扩散试验——LDL多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定——免疫球蛋白检测

一、本次实验的目的：1、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。2、掌握双向免疫扩散试验方法。3、掌握抗体效价的判断。4、掌握免疫浊度的测定原理。5、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。分类液体内沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫电泳单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应思考：抗原抗体反应的四大特点？特异性可逆性比例性阶段性沉淀反应的特点抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见)第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）

条件

电解质，温度，酸碱度

★根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类：（一）免疫扩散①单向免疫扩散试验(singlegeldiffusiontest)②双向免疫扩散试验(doublegeldiffusiontest)（二）凝胶免疫电泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫电泳双扩散免疫电泳一、单向免疫扩散试验(一)原理将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。(二)操作步骤

（平板法）1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。(三)方法评价单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L(四)影响因素1.抗原分子量

抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。

2.抗体种类实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。3.抗体稀释度

抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。(二)操作步骤

（平板法）融化琼脂，浇板每张载玻片约4ml。凝固，打孔孔径3mm，孔间距3~5mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。加样在相对孔内加抗原或抗体。孵育使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。(三)双向免疫扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体及其相对含量将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。2.抗原性质分析利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图。

三种扩散基本图型3.抗体效价滴定用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。4.抗体或抗原纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。双扩散试验优缺点优点：简单易行，用途广泛缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。（二）类型透射免疫比浊法散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法

1透射免疫比浊法原理：

抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。方法评价：优点：①灵敏度比单扩法高5—10倍；②CV小于10％；③操作简便快速，1h可报告结果；④结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。缺点：抗体用量较大；检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；不宜用于药物等半抗原的测定；灵敏度较散射比浊法低。2散射免疫比浊法原理：

散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(ratenephelometry)和终点散射比浊法(endpointnephelometry)。3免疫胶乳比浊法原理选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b）结合后，则形成光线衰减方法评价敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。

总评价缺点：测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。优点：①自动化②快速(30～60s)③灵敏(μg/L)④准确⑤精密度高(CV<5％)⑥稳定性好⑦节省试剂⑧检测范围广⑨不需减去样本和试剂本底值等优点。(三)免疫比浊法主要影响因素抗原抗体比例抗体的质量抗原抗体反应的溶液增浊剂的使用1抗原抗体比例高剂量钩状效应（highdosehookeffect)海德堡（heidelberger）曲线理论2抗体的质量（1）特异性高（2）效价高（3）亲和力高（4）抗血清来源3抗原抗体反应的溶液pH6.5~8.5电解质离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）4增浊剂的使用PEG、tween-20等非离子型亲水剂作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。本次实验内容实验一、双向免疫扩散试验——LDL多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定——免疫球蛋白检测

血清的采集与处理取血方法：血清的采集：耳缘静脉取血或颈动脉取血。血清处理：

取好血后，放入