第九章植物的基因工程

1.提高植物的农业价值和园艺价值。2.生物反应器3.研究基因的作用二、转基因植物的主要目的充当某些重要蛋白质或次生代谢产物的廉价反应器。研究基因在发育及其他生理过程和代谢途径中的作用。现在是1页\一共有118页\编辑于星期四三、植物基因工程的紧迫性1.粮食短缺（1）人口增加（2）耕地减少①土壤沙化②工业污染（3）气候改变饥荒现在是2页\一共有118页\编辑于星期四现在是3页\一共有118页\编辑于星期四现在是4页\一共有118页\编辑于星期四现在是5页\一共有118页\编辑于星期四2.传统育种方法的缺点（1）杂交性状难选择（2）远缘亲本难杂交（3）杂交过程耗时（4）不同物种不能杂交现在是6页\一共有118页\编辑于星期四到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。一个农业劳动力养活的人口数：美国：70人；日本：约25人；中国：4-5人。

现在是7页\一共有118页\编辑于星期四四、植物基因工程的优势1.植物细胞的全能性（totipotency）几乎任何部位的单细胞都可以再生出完整的植株。2.植物容易大面积栽培叶片，茎尖分生组织,种子,幼胚,胚性悬浮细胞,胚性愈伤组织。大麦，燕麦，小麦，水稻，玉米，甘蔗，向日葵，香蕉，黄瓜，大豆，菜豆，烟草，棉花，杨树，云杉，兰花，苜蓿等。现在是8页\一共有118页\编辑于星期四可以把人的基因、植物的基因、动物的基因，任何一个基因都可以组合到植物里去。4.快速育种1997年，中国也发表了第五号国情报告，预测了中国21世纪的粮食问题，报告认为："中国农业的出路最终要由生物工程来解决。"3.能接受任何基因拿一个抗病基因转进去，短时间内就得到一个抗病品种。现在是9页\一共有118页\编辑于星期四真正能够被中国老百姓吃到嘴里的国产转基因食品只有甜椒（一种柿子椒）和延熟西红柿两个品种。从1996年美国允许第一例转基因食品在超市出售以来，西方人已经吃了大约14年的转基因食品！现在是10页\一共有118页\编辑于星期四●转基因技术能对农作物的质量、数量进行精确的改良和提高，大大降低了生产成本，缓解了环境不断恶化的情况

●今天我们种植的绝大部分作物已经不是自然进化而生的野生种，人类现在食用的食物其本质也是转基因食物现在是11页\一共有118页\编辑于星期四转基因植物安全性等的释疑

(一)食品安全性问题1、外源基因DNA作为食品成分的安全性问题：不存在

所有生物的DNA分子具有相同的化学属性，我们每天都随食物吃进各种基因的DNA。外源DNA在人的唾液中只能存活20分钟，在人的胃里只能存活8秒钟，在进入人体消化道后DNA就被降解成无遗传活性的单个碱基、磷酸和戊糖，它们是人的营养素而无害。现在是12页\一共有118页\编辑于星期四2、目标基因表达蛋白本身的安全性问题：视具体基因而论研究表明，目前已商业化的Bt等基因编码的蛋白本身对人和动物都是安全的，生食、熟食都无害。有些转基因产品要正确食用，比如转蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因的食品熟食无害，但不宜大量生食。如果一个基因编码的蛋白的确对人有害，则不会通过安全性评价，也不会走向市场。现在是13页\一共有118页\编辑于星期四3、外源基因是否会干扰转基因植物的代谢：具体分析如果外源基因使植物本身的成分含量上升或下降，可能表现为内在品质的变好或变差。如果由于外源基因的引入而新产生对人体有益的成分，则是好事。如果由于外源基因的引入而新产生对人体有害的成分，则不安全。如果由于外源基因的引入而新产生对人体中性的成分，不存在食品安全性问题，但要考虑是否会降低产量或其它品质成分。目前已商业化的转基因尚未发现因干扰植物代谢而产生安全性问题。现在是14页\一共有118页\编辑于星期四4、标记基因和报告基因的食品安全性问题：放心食用，未来更放心研究表明，目前商业化的标记基因(如NptⅡ)和报告基因(如gus)等编码的蛋白及其在转基因植株体内的代谢产物对人是无害的。还没有被充分研究肯定的标记基因和报告基因没有机会走向市场。目前世界上及我国已经成功开发了多种确定无害的标记基因和报告基因，以及标记基因和报告基因在植物体内自动删除的技术系统，为新一代转基因产品的安全性提供了保障。现在是15页\一共有118页\编辑于星期四(二)其它健康安全性问题抗生素抗性基因是否会形成人体的抗药性：风险基本不存在一是转基因食物在消化时，这些基因的核酸链会被消化分解。二是即使有完整基因进入吸收道，人体也没有吸收DNA分子的机理，因此不可能进入人体细胞，更不可能整合到我们的染色体中。三是转到植物中的抗生素抗性基因是受植物启动子驱动的，即使它们完整地进入肠道细菌中也不会表达，就不会使人产生抗药性。现在是16页\一共有118页\编辑于星期四唯一的可能性是进入肠道的完整基因与肠道细菌体内的相似基因发生同源交换，交换后要保证抗生素抗性基因仍然具有完整编码蛋白的能力，同时又要将它的植物启动子交换掉，而在距离上恰到好处地接上一个完整的细菌启动子，这几乎不可能，迄今未见报道。现在是17页\一共有118页\编辑于星期四(三)环境安全性问题1、是否会形成抗除草剂杂草：有可能，需严格管理转基因植物1)转基因作物有性繁殖，且附近存在可有性杂交的近缘作物和近缘杂草：则抗除草剂基因可能会通过花粉传播途径从目标作物→(近缘作物)→近缘杂草，因为基因漂移而产生抗除草剂杂草，用该除草剂就不能杀死该杂草。现在是18页\一共有118页\编辑于星期四2)转基因作物有性繁殖，但本地没有可杂交的近缘物种：不存在基因漂移，如种植转基因棉花。3)转基因作物为纯营养繁殖且基本不开花。4)美国等国完全依赖于化学除草，大规模种植转基因抗除草剂作物，则可能会产生抗除草剂杂草，但换一种其它原理的除草剂就可以轻松将其杀死。现在是19页\一共有118页\编辑于星期四2、是否会形成超级细菌：几乎不可能，但取决于科学家的道德除非科学家丧失道德，故意通过DNA重组技术制造超级细菌，否则在自然界不太可能产生对人威胁极大的超级细菌。基因工程所用的细菌和载体都是人工改造了的，已经把它们可能的风险降到了最低。比如，基因工程所用的大肠杆菌是限制修饰缺陷型和重组缺陷型，并且在非实验环境下很快死亡。现在是20页\一共有118页\编辑于星期四3、是否会打破生态链的自然平衡：有可能改变一些小食物链，应认真研究，但也不必过于担心种植转基因抗虫、抗病作物，可能会导致相关的病虫害种群密度改变，无法估计是好还是坏、对生态平衡的影响是大还是小，所以要认真研究。自然界本来就是动态演化的，从来都不是静止的，每年要灭绝上千种生物，也有新的物种产生，古之沦海，今之桑田，所以食物链变化不一定就必然带来灾难，需要实事求是地评价。现在是21页\一共有118页\编辑于星期四大斑蝶事件Bt基因可以针对性地杀死害虫，而不会影响其他昆虫和哺乳动物，但有人担心转基因花粉飘落到周围的杂草上后，会不会杀死其他昆虫，如大斑蝶。从1999年起连续3年，美国环境保护局(EPA)组织昆虫专家在美国和加拿大对大斑蝶进行了跟踪研究，结论是转基因植物的花粉在田间对大斑蝶没有威胁。现在是22页\一共有118页\编辑于星期四现在是23页\一共有118页\编辑于星期四中国农业大学食品与营养工程学院院长罗云波教授说：“转基因技术与常规杂交育种技术虽然方法不同，但本质是一样的，都是在原有物种的基础上对遗传基因进行改造，只不过基因工程改造更为精确、更有预见性、效率更高，在严格控制下，好的、有用的基因被植入，坏的、无用的基因被删除，来源清楚、结构明确、数量有限，可以监控，比常规杂交育种更能保证安全性。”现在是24页\一共有118页\编辑于星期四(四)伦理道德问题跨越物种的基因交换与伦理道德问题：不是问题的问题1）自然界本来就广泛发生着跨越物种的基因交换，比如马与驴杂交，白菜与甘蓝杂交等。现在的常规育种经常采用种间甚至属间杂交来交换遗传物质和有用基因，达到育成新品种的目的，如海岛棉与陆地棉的杂交、水稻与野生稻的杂交等。现在是25页\一共有118页\编辑于星期四2)基因工程与杂交育种一样，只是实现了跨越物种间的遗传物质交换，只不过传统育种是同时交换整个基因组，一次交换的是成千上万的基因，而基因工程一次交换的只是一个或少数几个特定基因而已，但它们遵循的生物学法则是一样的。3)在植物中表达微生物或动物的单个基因，并没有改变种性，只是改良了单个性状，并没有人们大块吃动物的肉这样残忍。现在是26页\一共有118页\编辑于星期四(五)生物技术的国际竞争问题

基因专利：基因工程的核心知识产权在于基因本身，有用的基因和DNA元件是有限的，美国等发达国家率先将重要的功能基因和基因操作技术研发并专利化，后来者将十分不利。进口转基因农产品的反思：我国每年进口大量的转基因油菜、大豆、玉米、棉花，国人在不知不觉中消费大量转基因产品的同时，却对转基因不能正确地理解，甚至对国产转基因的产业化采取过严的限制。这种讽刺性现象不利于我国转基因产业的成长。现在是27页\一共有118页\编辑于星期四转基因工程技术主要用于提高浓作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.现在是28页\一共有118页\编辑于星期四五、植物的基因导入方法1.Ti质粒转化（详见第八章中“外源基因在植物中表达”）单子叶植物如小麦等几种重要的农作物和一些重要的花卉（百合、郁金香），难以用农杆菌转化。2.基因枪法（biolistics）通过基因枪把基因转化到植物组织的一部分细胞中，从这些细胞再生出完整的植株。是最有前途的植物DNA转移系统之一。现在是29页\一共有118页\编辑于星期四（1）用基因枪转化过程①沉淀外源DNACaCl2、亚精胺或聚乙二醇沉淀DNA。②外源DNA子弹DNA包裹在直径约1-4m的球状金粉或钨粉颗粒，称为“子弹”。③射击受体植物基因枪用火药或压缩氦气为动力射击（300-600m/s）。把包裹DNA的子弹射入植物细胞。现在是30页\一共有118页\编辑于星期四子弹进入细胞后，DNA会以一种目前人们不知道的方式整合到植物的染色体上。3.基因枪技术的缺点（1）整合的基因是多拷贝的。④外源基因整合转化（2）整合的基因位点不确定。有可能干扰植物的正常基因表达。现在是31页\一共有118页\编辑于星期四基因枪法获得转基因植物成功的实例植物种转化受体外源基因基因枪类型烟草叶片胚性悬浮细胞GUS,HptGUS,Npt-II火药式气动式大豆茎尖分生组织未成熟种子胚性悬浮细胞成熟种子GUS,Npt-IIGUS,Npt-IIGUS,HptGUS,bar放电式放电式火药式火药式棉花胚性悬浮细胞茎尖分生细胞GUS,HptGUS,Npt-II气动式放电式菜豆分生组织GUS,bar放电式黄瓜胚性愈伤组织Npt-II火药式番木瓜胚性悬浮细胞幼胚GUS,Npt-IIGUS,Npt-II,cp火药式火药式现在是32页\一共有118页\编辑于星期四植物种转化受体外源基因基因枪类甘蔗胚性悬浮细胞GUS,Npt-II火药式香蕉胚性悬浮细胞GUS,Hpt气动式杨树胚性悬浮细胞GUS,Bt放电式云杉胚性悬浮细胞GUS,Npt-II放电式向日葵受精胚珠GUS放电式苜蓿胚性愈伤组织Npt-II气动式燕麦胚性悬浮细胞GUS,bar火药式大麦胚性悬浮细胞GUS,bar气动式兰花球茎Npt-II,cp火药式现在是33页\一共有118页\编辑于星期四玉米成熟胚GUS火药式胚性悬浮细胞GUS火药式胚性愈伤组织Hpt火药式幼胚Bt气动式胚性悬浮细胞GUS气动式胚性愈伤组织Bar气动式水稻成熟胚GUS火药式幼胚GUS,bar,Hpt放电式胚性悬浮细胞bar气动式胚性愈伤组织GUS,bar火药式小麦胚性愈伤组织GUS,bar火药式盾片愈伤组织GUS火药式幼胚GUS,bar气动式、火药式现在是34页\一共有118页\编辑于星期四①优点体积小、容易操作、感染率高。②缺点3.病毒衍生载体至今没有证据表明植物病毒是否会整合到植物基因组中。目前常用烟草花叶病毒（TMV）。利用病毒外壳基因的启动子来表达外源基因。③载体病毒现在是35页\一共有118页\编辑于星期四外源基因转入植物细胞的方法及其评价方法评价Ti质粒介导一种有效的基因转移系统基因枪适用范围广，经济实用，稳定整合效率低。病毒载体效率很低直接将DNA导入原生质体仅限于能由原生质体再生出植株的植物显微注射法技术要求高，费时费力，一次只能操作一个细胞电击法仅限于能由原生质体再生出植株的植物脂质体融合法仅限于能由原生质体再生出植株的植物现在是36页\一共有118页\编辑于星期四植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物产高品质产物的转基因植物现在是37页\一共有118页\编辑于星期四1.第一类机制（1）非寄主抗性（non-hostresistance）：一种病原只能侵染某一种植物，而不能侵染其它植物。一、植物抵御病原菌侵染的机制（2）特点①没有病原小种专一性。②可长期保持。③有应用价值。第二节植物抗病基因工程现在是38页\一共有118页\编辑于星期四防卫反应：通过识别入侵的病原而诱导产生的一系列防卫反应。（3）第三类机制（2）第二类机制植物自身的结构屏障（细胞壁的结构、小分子的抗病物质）。现在是39页\一共有118页\编辑于星期四1.基因对基因（geneforgene）假说二、植物抗病的分子机理1941年Flor提出是克隆病原无毒性基因和植物抗病基因的理论基础。对应于寄主方面的每一个决定抗病性的基因，病原物方面也存在一个决定致病性的基因。反之，对应于病原物方面的每一个决定致病性的基因，寄主方面也存在一个决定抗病性的基因。现在是40页\一共有118页\编辑于星期四2.植物的抗病物质植物的抗性基因产生受体，与诱导物结合激发一系列的信号传递途径，最后诱导植物产生防卫反应。植物的防卫反应涉及到多种防卫基因的表达，产生多种抗病物质：（1）小分子抗病物质豆科植物的异黄酮类、茄科植物的萜类、植物抗毒素、毒性苷元、毒性不饱和脂肪酸、毒性小分子酚类化合物等。现在是41页\一共有118页\编辑于星期四（2）病原相关蛋白（PR）壳多糖酶、-1，3-葡聚糖酶等。能降解病原真菌细胞壁。（3）阻止病原扩散的细胞壁成份伤口部位胞壁栓质化、病原入侵部位胞壁的胼底质生成、富含羟脯氨酸和富含甘氨酸的糖蛋白、木质素、富含硫的毒素的小肽（thionin）、导管中侵填体（tylose）的生成。现在是42页\一共有118页\编辑于星期四三、植物抗病基因的克隆字母缩写：NBS（核苷酸结合位点）；LZ（亮氨酸拉链）；LRR（富含亮氨酸的重复区）；R基因植物病原Avr基因基因产物Hml玉米Cochlioboluscarbonum无HC-毒素还原酶Pto番茄Pseudomonassyringaepv.tomatoavrPto丝/苏氨酸蛋白激酶Cf-2,4,9番茄CladosporiumfulvumAvr2,4,9LRRPrf番茄p.syringaepv.tomatoavrPtoLZ,NBS,LRRI2番茄Fusarivmaxysp[orum未知NBS,LRRRps拟南芥PseudomonassyringaeavrRpt2LZ,NBS,LRR现在是43页\一共有118页\编辑于星期四Rpm1拟南芥p.syringaepv.maculicolaavrRpm1,avrBLZ,NBS,LRRRpp5拟南芥PeronosporaparasiticaavrPp5NBS,LRRN烟草TMV未知Toll,NBS,LRRL6亚麻Melampsoralini未知Toll,NBS,LRRM亚麻m.lini未知NBS,LRRXa21水稻Xanthomanasoryzaepv.oryzae未知LRR,蛋白激酶Xa1水稻Xanthomanasoryzaepv.oryzae未知NBS,LRRsHslpro-1甜菜Hteroderaschachtil未知LRR现在是44页\一共有118页\编辑于星期四四、植物杀菌肽基因工程很多昆虫中存在一些能杀菌的蛋白和多肽。1.结构和功能特点①由30多个氨基酸残基组成②N端由碱性氨基酸残基组成③C端均酰胺化④绝大多数多肽的第二位都是Trp（对杀菌活性至关重要）⑤都有较广的杀菌谱。尤其是对很多植物病原菌有较强的杀伤作用现在是45页\一共有118页\编辑于星期四还不彻底清楚。作用于细菌的细胞膜，破坏膜的通透性，造成离子通道，最终导致细胞内含物泄漏。人工合成杀菌肽基因（分子量小）。用35S启动子或植物特异性启动子。中国成功地把人工合成的cercropinB基因导入马铃薯，获得抗马铃薯清枯病的转基因马铃薯。3.杀菌肽基因转入植物2.杀菌机理现在是46页\一共有118页\编辑于星期四第三节农作物抗虫基因工程早期：培育产量更高的新品种。现在：培育有抗性的品种。抗昆虫、病毒、除草剂、环境胁迫、衰老。抗虫植物现在是47页\一共有118页\编辑于星期四（1）害虫产生抗药性。（2）益虫也受害。（3）药物残留，破坏环境。一、基因工程抗虫的必要性2.基因工程抗虫的优点（1）连续使用，成本低。（2）保护作用遍及全株。（3）不扩散，安全。（4）只杀害虫，特异性强。1.化学杀虫的缺点现在是48页\一共有118页\编辑于星期四现在是49页\一共有118页\编辑于星期四

昆虫对农作物的危害极大，全世界每年因此损失数千亿美元。目前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂，它不但严重污染环境，而且还诱使害虫产生相应的抗性。将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫作物已占全球转基因作物的22％。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最为广泛。现在是50页\一共有118页\编辑于星期四1.苏云金杆菌的Bt毒蛋白2.蛋白酶抑制剂的基因3.淀粉酶抑制剂4.外源凝集素基因二、抗虫基因的种类三、苏云金杆菌苏云金杆菌（bacillusthuringiensis,Bt）感染鳞翅目、膜翅目昆虫，杀虫谱较窄。1901年发现。已发现4万多个Bt菌种。现在是51页\一共有118页\编辑于星期四Bt芽孢伴胞晶体昆虫吞食肠道内萌发进入血液引起败血症释放肠道碱性特定蛋白酶活性毒性蛋白分子小肠上皮细胞离子通道ATP,Na+流出昆虫脱水死亡原毒素1.杀虫机理现在是52页\一共有118页\编辑于星期四2.原毒素基因苏云金杆菌有7个质粒，大小分别是：杀虫原毒素基因位于其中一个质粒上（71kb）。2.0kb、7.4kb、7.8kb、8.2kb、14.4kb、45kb、71kb3.原毒素基因的分离和克隆1-646aa保守高变区变化NC毒性区域估计为受体接合部位，决定毒素的特异性杀虫现在是53页\一共有118页\编辑于星期四Bt总DNA染色体DNACsCl密度梯度离心质粒DNA质粒DNARNA取出大质粒中质粒小质粒蔗糖梯度离心弃掉Sau3A1部分酶切DNA片段pBR322BamHI转化E.coli产物杀虫素抗体放射自显影I125蛋白A现在是54页\一共有118页\编辑于星期四4.Bt蛋白基因分类已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因：（1）CryI基因编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白。（2）CryII基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白。现在是55页\一共有118页\编辑于星期四（3）cryIII基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体。（4）CryIV基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭圆形伴孢晶体。由于一个特定的转录因子只在苏云金杆菌芽孢形成阶段启动原毒素基因转录，Bt只在此阶段合成原毒素。5.Bt毒蛋白的形成现在是56页\一共有118页\编辑于星期四四、重组苏云金杆菌从蜡状芽孢杆菌的质粒中找到一个组成型表达的抗四环素基因和其启动子。把抗四环素的启动子与原毒素基因重组，形成结构性表达原毒素的重组质粒。转化苏云金杆菌，使该菌在整个生活史中一直表达原毒素。可以把不同来源重组，提高效率和杀虫谱。1.启动子2.启动子和原毒素基因重组3.重组质粒转化Bt现在是57页\一共有118页\编辑于星期四野生型和重组苏云金杆菌的毒性比较毒素来源对白菜粉蝶的毒性（吃掉菜叶）对蚊子的毒性（死亡率）对甲虫的毒性（吃掉萝卜叶）内源毒素（亚种）转入的外源毒素（亚种Aizawai无0-5%24h,50-100%>50%Israelensis无>5%1h,100%IsraelensisAizawai0-5%1h,100%IsraelensisTenebrionis5-50%0-5%Kurstaki无0-5%24h,50-100%>50%KurstakiTenebrionis0-5%0-5%Tenebrionis无>50%24h,0%0-5%TenebrionisAizawai0-5%24h,50-100%5-50%现在是58页\一共有118页\编辑于星期四（1）载体：Ti质粒。共整合载体。（2）启动子：35S强启动子，增加表达量。（3）Bt基因：N端1-646氨基酸。（4）转化菌：农杆菌。五、转Bt基因抗虫植物1.Bt杀虫毒素基因载体的构建2.转化农杆菌介导。现在是59页\一共有118页\编辑于星期四SperNPTr:kanamycin,neomycin,G418Nos:nopalinesynthase现在是60页\一共有118页\编辑于星期四Bt基因含有较多的AT碱基和ATTTA重复序列。AT富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子。ATTTA重复序列的mRNA的稳定性差，二者都不能在高等植物中编码。3.转Bt植物基因工程的改进（1）野生型Bt毒素基因的缺点现在是61页\一共有118页\编辑于星期四主要目的是设法提高Bt毒素的表达量①应用强启动子，如CaMV启动子。②改掉可能降低其在植物宿主中转录和翻译效率的部分序列（3.5%）。③人工设计，采用植物偏爱密码子。④删除可能形成mRNA二级结构的序列。⑤去掉所有ATTTA序列。⑥降低AT含量。经过改进，表达量提高了5-100倍。（2）采取的改进方法现在是62页\一共有118页\编辑于星期四4.转Bt基因植物工程植物目的基因转化方法烟草CryIA(a)（抗烟草天蛾）CryIA(b)（抗烟草天蛾）CryIA(c)（抗烟草青虫）Bt(获纯合体株系Ｄ8-14，Ｄ19-8)CryIA(b)（切去3’端，留640序列）农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导番茄CryIA(b)(抗口科鳞翅目)Bt（抗番茄果虫，番茄蠹蛾）CryIa(b)（减少Ａ＋Ｔ含量）Bt+CMV-CP农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导马铃薯CryIIIACryIIIACryIA(c)农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导现在是63页\一共有118页\编辑于星期四棉花Bt(转原生质体)Bt（下胚轴NPT

II

Kan’）Bt农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导粳稻CryIA(抗稻纵叶卷螟)电击法（原生质体）水稻BtCryIA(b)（未见抗虫性报道）CryIA(b)CryIA(b)

CryIA(c)ＰＥＧ法（ＰＢＩ121）花粉管通道法基因枪法（胚性愈伤）农杆菌介导籼稻CryIA(b)基因枪法籼稻和粳稻CryIA(b)（三化螟）基因枪法现在是64页\一共有118页\编辑于星期四玉米CryIA(b)Bt、barBtBt基因枪法子房注射超声波基因枪法大豆Bt（未见杀虫效果报道）Bt农杆菌介导（LBA4404）侵染子叶节苹果Bt农杆菌介导甘蔗CryIA(c)（抗非洲蔗螟）农杆菌介导现在是65页\一共有118页\编辑于星期四现在是66页\一共有118页\编辑于星期四害虫种类野生型番茄转Bt基因番茄不加杀虫剂加杀虫剂不加杀虫剂加杀虫剂烟草天蛾中等程度损伤几乎未损伤几乎未损伤完全未损伤番茄谷实夜蛾中等程度损伤几乎未损伤番茄茎麦蛾严重损伤严重损伤严重损伤中等程度损伤野生型和转Bt毒蛋白基因番茄的抗虫能力比较现在是67页\一共有118页\编辑于星期四5.Bt毒素转基因植物存在的问题和措施Bt毒蛋白是目前使用范围最广，最有潜力的一个抗虫基因。①抗虫谱窄随着Bt转基因植物大面积种植，给昆虫造成高选择压力，很快会产生抗性。每一种毒素只针对一类害虫。②有可能是害虫产生抗性（1）存在的问题现在是68页\一共有118页\编辑于星期四（2）采取的措施：①分离新的Bt毒蛋白基因。②对Bt毒蛋白基因进行人工改造，提高其表达量。③同时使用两个以上的Bt毒蛋白基因，或与其他抗虫基因联合转基因。④降压法：使Bt毒蛋白基因只在容易被害虫侵染的组织器官中表达，或只在发育的某个阶段表达，降低对昆虫的选择压力。⑤大田种植时轮换、混种、及时淘汰有可能使昆虫产生抗性的转基因抗虫作物。现在是69页\一共有118页\编辑于星期四六、转蛋白酶抑制剂基因抗虫植物蛋白酶抑制剂（proteinaseinhibitor,PI）分子大小：一般是60-120氨基酸的多肽。存在于豆科、茄科植物的块茎和种子中。1.抗虫机理PI同昆虫消化道内的蛋白消化酶形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解作用，使昆虫厌食或消化不良致死。该复合物还能刺激昆虫消化酶的过量分泌，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应。现在是70页\一共有118页\编辑于星期四蛋白消化酶PI复合物现在是71页\一共有118页\编辑于星期四2.PI的种类现在发现近10个PI家族，研究的最清楚的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中最主要的是胰蛋白酶抑制剂（而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微）。3.抗虫基因工程中应用的几种PI（1）CpTI基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。（Cowpeatrypsininhibitor，CpTI）由80个氨基酸组成，富含二硫键。只在发育的种子中表达。现在是72页\一共有118页\编辑于星期四（2）PTI基因马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因。（potatoproteininhibitor，PTI）分为两类：PTI-I,PTI-IIPTI-II基因的启动子是损伤诱导性调控启动子，在抗虫基因工程中有应用潜力。CpTI抗虫效果较为理想：其抗虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有昆虫都有杀伤作用。作用位点在酶的活性中心，突变的可能性小，昆虫产生抗性突变的可能性几乎没有。现在是73页\一共有118页\编辑于星期四玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。（3）CPI基因（4）SKTI基因大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因。现在是74页\一共有118页\编辑于星期四转蛋白酶抑制剂基因植物工程植物目的基因转化方法烟草CpTIPTI农杆菌介导农杆菌介导水稻CpTISKTI（抗棉铃虫）CpTI（抗二化螟、三化螟）CPI（抗线虫）CPI（抗玉米象）农杆菌介导农杆菌介导直接转化基因枪法基因枪法现在是75页\一共有118页\编辑于星期四七、转淀粉酶抑制剂抗虫植物-amylaseinhibitor普遍存在于植物中，尤其在禾谷类作物和豆科作物的种子中含量更高。1.抗虫机理普遍抑制哺乳动物及昆虫体内的淀粉酶，阻断昆虫对食物中淀粉的消化，但对植物本身和细菌的淀粉酶不起作用。2.缺点：不适宜在农作物中应用（抑制哺乳动物体内的淀粉酶）。只在烟草等经济作物中应用。现在是76页\一共有118页\编辑于星期四八、转外源凝集素基因抗虫植物lectin能特异地识别并可逆地结合糖类复合体的糖基部分，而不改变被识别的糖基的共价结构的一类非免疫性球蛋白。1.抗虫机理主要储存在植物细胞的蛋白粒中，一旦被害虫摄食，就会在昆虫的消化道里释放出来，与肠道围食膜上的糖蛋白结合，影响营养物质的正常吸收。对人和家畜有无副作用在豆科植物的种子中含量最丰富。现在是77页\一共有118页\编辑于星期四第四节抗病毒作物基因工程现在是78页\一共有118页\编辑于星期四①单链DNA病毒②双链DNA病毒一、植物病毒类型和侵染过程1.植物病毒类型①正链RNA病毒种类最多，占植物病毒75%。②负链RNA病毒③双链RNA病毒（1）DNA病毒（2）RNA病毒现在是79页\一共有118页\编辑于星期四（1）交叉保护预先感染了温和株系病毒的植物，可以在一定程度上对与温和株系病毒亲缘关系较近的的强病毒株系的侵染产生抗性。（1929年发现。）温病毒A植物强病毒A亲先后二、植物抗病毒的原理在转基因抗病毒植物中，应用最广的方法就是植物的交叉保护原理。现在是80页\一共有118页\编辑于星期四2.植物病毒的侵染过程脱壳（decapsidation）病毒编码蛋白的翻译（translation）病毒基因组的复制（replication）病毒颗粒的包装（encapsidation）现在是81页\一共有118页\编辑于星期四3.病毒外壳蛋白的结构和功能①宿主细胞的识别。②保护病毒核酸。由蛋白亚基组成。在植物中表达外壳蛋白后能产生类似于交叉保护的效果。（机理不清楚）。（1）结构（2）功能现在是82页\一共有118页\编辑于星期四1.温和病毒在野外有可能突变成强病毒。2.温和病毒在被保护的植物中复制，不安全。三、直接使用温和病毒的弊端四、基因工程技术构建抗病毒植物1.利用病毒外壳蛋白介导的抗性。（1）构建携带病毒外壳蛋白基因的载体Ti质粒共整合载体。现在是83页\一共有118页\编辑于星期四现在是84页\一共有118页\编辑于星期四（2）成功的转基因抗病毒植物烟草、番茄、苜蓿、马铃薯等。烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、苜蓿花叶病毒（AlMV）、烟草条纹病毒（TSV）、烟草脆裂病毒（TRV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草蚀刻病毒（TEV）等20多种病毒。②涉及到的病毒（外壳）①抗病毒植物现在是85页\一共有118页\编辑于星期四2.反义RNA（AntisenseRNA）介导的抗性与转录所得的mRNA（正义RNA）序列互补的RNA。（1）反义RNA（2）反义RNA的作用机制①与mRNA互补配对，阻止mRNA翻译。②配对后引起mRNA被降解现在是86页\一共有118页\编辑于星期四现在是87页\一共有118页\编辑于星期四利用病毒外壳蛋白的反义RNA序列。Ti质粒载体。抗病效果不理想。（3）反义RNA的基因工程及其效果①载体构建②实际效果评价现在是88页\一共有118页\编辑于星期四3.利用缺损的病毒复制酶抗病毒（1）原理表达无功能的缺损复制酶可以与有功能的完整病毒复制酶竞争底物，干扰病毒的正常复制。竞争抑制。缺损复制酶完整病毒复制酶病毒核酸不复制复制结合现在是89页\一共有118页\编辑于星期四（2）缺损的病毒复制酶与转基因抗性效果TMV复制酶的C端、豌豆早枯病毒（PEBV）复制酶的C端。②效果评价：大有前途。①转入成功的缺损酶分别转入烟草后，发现转基因烟草对TMV、PEBV、胡椒环斑病毒（PRV）和TRV都表现出抗性。现在是90页\一共有118页\编辑于星期四在大田里，尽管每年花费上百亿美元使用100多种化学除草剂，但杂草的生长仍使农作物减产10%。目前使用的除草剂特异性不强，或多或少会影响农作物的生长。利用转基因技术构建抗除草剂的重组植物可望解决这一问题，其战略包括：抑制农作物对除草剂的吸收高效表达农作物体内对除草剂敏感的靶蛋白降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性向农作物体内导入除草剂的代谢灭活能力第五节抗除草剂抗衰老抗早熟基因工程现在是91页\一共有118页\编辑于星期四草甘磷（glyphosate）。特点：可被土壤微生物降解的、对环境无害的除草剂。抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enlopyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS）。一、抗除草剂基因工程1.常用的除草剂2.草甘磷的主要作用机理现在是92页\一共有118页\编辑于星期四EPSPS是植物和细菌的芳香类氨基酸合成途径（莽草酸途径）的一个重要的酶。从细菌中分离抗草甘磷的大肠杆菌EPSPS基因，转入植物中表达。3.抗除草剂基因工程作物的策略（1）EPSPS抗性基因策略给农作物转入EPSPS抗性基因，弥补植物中受草甘磷抑制的EPSPS，抵抗草甘磷。现在是93页\一共有118页\编辑于星期四Glyphosateresistance转移现在是94页\一共有118页\编辑于星期四3，5-二溴-4-羟基苯腈（bromoxynil）是一种抑制植物光合作用的除草剂。细菌中的腈水解酶（nitrilase）。在植物中表达能使除草剂失活的酶。（2）除草剂失活的酶基因策略①作用的除草剂②降解酶3，5-二溴-4-羟基苯腈3，5-二溴-4-羟基苯甲酸腈水解酶现在是95页\一共有118页\编辑于星期四二、抗衰老基因工程细菌腈水解酶基因抗衰老氧离子基团一般以超氧化物阴离子形式出现。置于光调控启动子转入植物中，使植物对该除草剂产生抗性。超氧化物歧化酶超氧化物过氧化氢水过氧化氢酶把超氧化物歧化酶基因转入植物体内过量表达，可以延迟植物衰老。尤其延缓花瓣变质凋谢。现在是96页\一共有118页\编辑于星期四蔬菜和水果成熟后，其组织呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并迅速导致果实皱缩和腐烂。控制蔬菜水果细胞中乙烯合成的速度，能有效延长果实的成熟状态及存放期，为长途运输提供了有利条件，具有重要的经济价值。植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科学家采用反义RNA技术封闭番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，由此构建出的重组番茄的乙烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。三、抗早熟基因工程现在是97页\一共有118页\编辑于星期四（1）纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶等。1.与果实成熟有关的酶（2）乙烯合成途径中的酶：ACC合成酶乙烯合成酶ACC脱氨酶乙烯能诱导与果实成熟和衰老有关的许多基因的表达。现在是98页\一共有118页\编辑于星期四乙烯合成途径S-腺苷甲硫氨酸ACC合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）乙烯合成酶乙烯-酮丁酸ACC脱氨酶现在是99页\一共有118页\编辑于星期四2.抗早熟的基因工程策略在植物中转入纤维素酶或多聚半乳糖醛酸酶基因的反义RNA基因，可以干扰这两种酶的表达。（1）反义RNA技术番茄转入多聚半乳糖醛酸酶反义RNA后，多聚半乳糖醛酸酶的活性下降了90%。达到了延缓番茄在运输和储藏过程中的早熟。效果评价：现在是100页\一共有118页\编辑于星期四（2）ACC脱氨酶转入从细菌中筛选分离ACC脱氨酶基因，转入番茄表达，减少番茄储藏和运输过程中腐烂变质。基因工程保鲜番茄是美国批准的第一个大规模生产的转基因食用作物（1993）。1986年在美国伊利诺思州成功地培育出了世界第一批转基因植物，而陈章良那时不但参加了此项研究的全程跟踪，与同伴们一起亲手栽培了那批引人注目的转基因抗病毒西红柿.现在是101页\一共有118页\编辑于星期四第六节花卉的基因工程重要的花卉品种：玫瑰、康乃罄、兰花、郁金香、菊花。主要用基因工程的方法改变花的颜色和影响开花期。增加观赏价值。现在是102页\一共有118页\编辑于星期四花卉的颜色是由花冠中的色素成分决定的。大多数花卉的色素为黄酮类物质，由苯丙氨酸通过一系列的酶促反应合成，而颜色主要取决于色素分子侧链取代基团的性质和结构，如花青素衍生物呈红色，翠雀素衍生物呈蓝色等。在黄酮类色素的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。利用反义RNA技术可有效抑制矮牵牛花属植物细胞内的CHS基因表达，使转基因植物花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，并且对CHS基因表达抑制程度的差异还可产生一系列中间类型的花色。改变花卉的颜色现在是103页\一共有118页\编辑于星期四植物激素在控制花朵的形状和大小方面起着重要的作用。例如，细胞分裂素与植物生长素的比值可以决定植株包括花的形状。分子生物学和遗传学的研究都表明，同源异形基因表达的加强或减弱都会改变花的大小和形状，而这些基因的表达时间直接影响到植物的花期。同源异形基因控制花形的过程十分保守，在几乎所有的观赏花卉中都是一样的，这就为人们用基因工程的方法改变花形和花期提供了有利条件。改变花卉的形状现在是104页\一共有118页\编辑于星期四一、植物花色素合成途径4-香豆酰辅酶A山梨酰辅酶A查尔酮查尔酮合成酶黄酮-3-羟化酶花青素（cyanidin）的衍生物翠雀素（delphinidin）的衍生物中间产物花色偏红花色偏蓝现在是105页\一共有118页\编辑于星期四二、转基因花卉把玉米的二羟黄酮醇-4-还原酶（DFR）基因转入矮牵牛，获得了开橙色花的品种。蓝色色素合成是由多种酶控制的。主要利用基因工程改变花的颜色。1.目的2.转成功的花卉3.蓝色控制较复杂现在是106页\一共有118页\编辑于星期四翠雀素的合成要有3个条件：①3’，5’-羟化花色素苷（翠雀素）的合成。②黄酮醇辅色素的存在。③液泡中的pH相对高。3’，5’-类