DB3301T 1096-2018南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法

ICS65.150B50浙江DB3301省杭州市地方标准DB01/T1096—2018杭州市质量技术监督局发布前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由杭州市农业局提出并归口。本标准起草单位：杭州市水产技术推广总站、杭州萧山农技推广中心水产站、杭州大洋庄园农业发展有限公司。本标准主要起草人：叶键、施礼科、许婷、王力、徐铃威、陈凡、蒋静、韩钶、王国成。1DB3301/T1096—2018南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法1范围本标准规定了南美白对虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)聚合酶链式反应(PCR)检测的材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于南美白对虾肝肠胞虫的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3检测材料3.1水符合GB/T6682中一级水的要求。aq-20℃保存，避免反复冻融。3.3dNTPs含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。3.4引物有两对引物，浓度均为25μmol/L，其序列分别为：F1：5’-CAGCAGGCGCGAAAATTGTCCA-3’R1：5’-AAGAGATATTGTATTGCGCTTGCTG-3’，扩增778bp的片段；F2：5’-CAACGCGGGAAAACTTACCA-3’R2：5’-ACCTGTTATTGCCTTCTCCCTCC-3’，扩增上述片段中的176bp片段。3.5DNA分子量标准推荐使用DNAladder100，各片段大小依次为：1500bp，1000bp，900bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。3.6无水乙醇分析纯，使用前-20℃预冷。2DB3301/T1096—20183.7矿物油无DNA酶和RNA酶。4仪器和设备4.1PCR扩增仪4.2电泳仪输出直流电压0V~600V。4.3水平电泳槽50mL~500mL，带有凝胶船及样孔梳。4.4移液器量程0.5L~10L、10L~100L、100L~1000L移液器各1支及适配吸头，0.5L~10L移液器建议使用带滤芯吸头。4.5紫外透射仪或凝胶成像仪可遮挡可见光干扰，在230nm~300nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相功能。4.6恒温培养箱4.7冰箱具冷藏箱，并带-20℃以下冷冻箱体。4.8离心机转速可达15000r/min以上。5操作步骤5.1采样将待检虾置于采样容器内，加10倍体积以上的95%乙醇，没过待检样，常温保存，可保存30d。采样数量应符合SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范的要求。5.2样品处理将待检虾置于灭菌滤纸上，滤干乙醇。幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体。大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺组织。充分研磨混匀后取10mg~50mg的样品，置于1.5mL的离心管中，立即进行DNA抽提。5.3DNA抽提加150LCTAB溶液(见附录A.1)，研磨成糊状后再加CTAB溶液至900L。混匀后于25℃作用2h。加600L抽提液1(见附录A.2)，充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相；加700L抽提3DB3301/T1096—2018液2(见附录A.3)，充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相；加入1.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min以上；15000r/min离心30min，弃上清，37℃干燥5min；最后加20L双蒸水溶解，作为PCR模板。可以采用同等抽提效果的商品化DNA抽提试剂盒。5.4设立对照经序列测定确认为阳性和阴性的对虾组织，按5.3提取获得DNA，分别作为阳性对照和阴性对照；并以双蒸水作为空白对照。PCR5.5.1在0.2mLPCR管中加入10×PCR缓冲液(见附录A.4)5mL、25mmol/L氯化镁5mL、dNTP1mL、PCR仪时，在反应混合物上覆加25mL矿物油。5.5.2低速离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行扩增：94℃变性3min；94℃20s，58℃20s，72℃45s，35个循环；72℃5min；4℃保温。5.6琼脂糖凝胶电泳用1×TAE电泳缓冲液(见附录A.5)配置1.5%且含0.5g/mLEB(见附录A.6)的琼脂糖凝胶平板。将该凝胶平板放入水平电泳槽，加样孔朝负极，加入1×TAE电泳缓冲液至没过胶面1mm~2mm。将6 LPCR扩增产物和2μL样品缓冲液(见附录A.7)混匀后加入加样孔。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝迁移至琼脂糖凝胶的1/2~2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察并判断结果。PCR5.7.1第一步PCR扩增后的产物经电泳未见目的条带，取2mL产物作为模板；见到目的条带的，可不mLPCR管中加入10×PCR缓冲液5mL、25mmol/L氯化镁5mL、dNTP1mL、引物F2和R2各1mL、Taq酶5U、模板2mL，最后加双蒸水至50mL。在反应混合物上覆加25mL矿物油。5.7.3低速离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行扩增：94℃变性3min；94℃20s,68℃20s，72℃20s，35个循环；72℃5min；4℃保温。5.7.4琼脂糖电泳程序同5.6。6测序取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与GenBank中参考序列(见附录B)进行同源性比对。7结果判定7.1检测样品第一次PCR扩增后在778bp处出现条带，阳性对照在778bp处出现条带，阴性对照和空白对照没有该条带；对检测样品PCR产物测序，序列与附录B中F1至R1序列相同，判定为虾肝肠胞虫7.2检测样品第一次PCR扩增阴性产物，第二次PCR扩增后在176bp处出现条带，阳性对照在176bp处出现条带，阴性对照和空白对照没有该条带；对检测样品的第二次PCR产物测序，序列与附录B中F2至R2序列相同，判定为虾肝肠胞虫阳性；4DB3301/T1096—20187.3检测样品第一次和第二次PCR扩增均未出现特定条带，阳性对照分别在778bp和176bp处出现条带，阴性对照和空白对照没有出现相关条带，判定为虾肝肠胞虫阴性。AA5DB3301/T1096—2018附录A(资料性附录)试剂配置A.1CTAB溶液用2%CTAB，1.4mol/L氯化钠(NaCl)，20mmol/LEDTA，20mol/LTris-HClpH7.5配制。用前加巯基乙醇到终浓度0.25%。A.2抽提液1三氯甲烷/异戊醇(按24:1混合，密闭避光保存)。A.3抽提液2酚/三氯甲烷/异戊醇(按25:24:1混合，密闭避光保存)。A.410×PCR缓冲液Tris-HClKClTritonX-100500mmol/LpH调至8.8500mmol/LA.550×TAE电泳缓冲液TrisEDTA水冰乙酸242g18.612g800mL57.1mL用NaOH调pH至8.3，加水到1000mL，室温保存，使用时用水稀释50倍。A.6EB用水配制成10mg/mL的浓缩液。每10mL电泳液或琼脂中加1μL。A.7样品缓冲液每100mL含溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。6DB3301/T1096—2018BA附录B(资料性附录)虾肝肠胞虫(EHP)套式PCR检测产物序列1CCTGAGAGATGGCTCCCACGTCCAAGGATGGCAGCAGGCGCGAAAATTGTCCACTCTTTT61GAGAGGAGACAGTTATGAAACGTGAGTAGAAGGGTCGAGTGTAAAAACCTTGACGTGAAG121CAATTGGAGGGCAAGTTTTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAACTCCAAGAGTGTCTA181TGGTGGATGCTGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTAGATGCAATTAAAAGGTGGTGTTAAA241AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAG301AATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTAT361CTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAG421CAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATC481TTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGAC541GGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTA601CCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGT661TGGAAATTGAT