微生物的培养技术及应用第4课时课件 【知识精讲精研+能力拓展提升】 高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章

发酵工程第2节

微生物的培养技术及应用第4课时

微生物的数量测定（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。1、间接计数法——稀释涂布平板法选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；统计的菌落往往比活菌的实际数目低；统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。（2）计数原则：

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。一、微生物数量测定的基本方法（3）计算公式:每g样品中的菌落数＝（C÷V）×MM代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)例1：某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4（234÷0.1）×106=2.34×109答B一、微生物数量测定的基本方法（3）计算公式:每g样品中的菌落数＝（C÷V）×MM代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)例2：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个一、微生物数量测定的基本方法实例分析：

某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学____________________________________；原因是____________________________________。2.乙同学____________________________________；原因是____________________________________。实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太大，应舍去一、微生物数量测定的基本方法2、直接计数——计数板计数法（1）原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。一、微生物数量测定的基本方法每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数（2）缺点：①不能区分死菌与活菌；②个体小的细菌在显微镜下难以观察；③不适于对运动细菌的计数。微生物的计数方法比较内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×MC：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小一、微生物数量测定的基本方法1、实验目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌2、实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。3、操作步骤：制备培养基土壤取样样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基对照作用思考：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？①提供无机盐；②调节pH。（1）制备培养基二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。（2）土壤取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（3）样品的稀释

将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水10g在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数测定土壤中的细菌数量时，一般选用1×104、1×105、1×106、倍稀释的稀释液进行平板培养。微量移液器取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却8~10s后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。3、涂布平板①滴加菌液②涂布器消毒③涂布器灭菌④涂布平板各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。②每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。（4）微生物的培养与观察得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（5）结果评价①培养基的制作是否合格未接种培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基制备合格，否则需要重新制备。②接种操作是否符合无菌操作如果培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，符合菌落特点，说明操作是符合无菌操作；如果出现其他菌落，说明未达要求。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。（6）微生物的鉴定土壤中分解尿素的细菌的鉴定二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。（7）注意事项二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数微生物的选择培养和计数科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法稀释涂布平板法的操作过程间接计数法—稀释涂布平板法直接计数—计数板计数法微生物的数量测定选择培养基微生物的选择培养土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计课堂小结1、关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是()A.培养基应以尿素为唯一氮源，该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的B.对微生物进行分离、纯化用平板划线法，而稀释涂布平板法只能用于计数C.对10mL土样稀释106倍后，取0.1mL该溶液进行重复的涂布实验，测得的菌落数分别为18、234、276，则该10mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×108个D.应该设置对照以排除非测试因素对实验结果的干扰，提高可信度D[解析]从土壤中分离分解尿素的细菌时,培养基应以尿素为唯一氮源,尿素分解菌为异养型生物,利用的是有机碳源,硝化细菌是自养型生物,以二氧化碳为碳源,二氧化碳为无机物,A错误;平板划线法只能用来分离、纯化微生物,不能用于计数,稀释涂布平板法既能计数活菌数目,又能用于分离纯化,B错误;[(234+276)÷2]÷0.1×106×10=2.55×1010(个),C错误;课堂练习2、某兴趣小组在校园土壤中取样，进行“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验。小明从稀释倍数为106的培养基中筛选出约120个菌落，而其他同学只筛选出约40个菌落。下列有关叙述错误的是()A.小明出现这种结果的可能原因是和其他同学取样的土壤不同

B.要证明培养基是否受到污染，可将小明配制的培养基不加土样进行培养C.当稀释倍数太小时，可能由于菌落重叠而导致计数结果偏小D.在牛肉膏蛋白胨培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌D[解析]在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,可初步鉴定尿素分解菌,D错误。课堂练习3、下图是研究人员从红棕壤中筛选能高效分解尿素细菌过程示意图，有关叙述错误的是()C课堂练习A．在配制步骤②③的培养基时，应先调pH值后进行高压蒸汽灭菌B．步骤③纯化能分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落C．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力1、通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是()A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取1×104、1×105倍的土壤稀释液0.1mL，分别涂布于各组平板上C．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数D．将培养皿倒置，37℃恒温培养24～48小时2、下列有关土壤中能分解尿素的细菌的分离和计数的实验操作，错误的是()A．取土壤用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌B．测定土壤中细菌的数量一般选用1×102、1×103、1×104倍的稀释液进行平板培养C．鉴定能分解尿素的细菌，利用了尿素分解成氨，从而使pH升高的原理D．用牛肉膏蛋白胨培养基作对照，来验证选择培养基是否有选择性BC作业3、用稀释涂布平板法来统计样品中的活