海洋生物蛋白水解

本文格式为Word版，下载可任意编辑——海洋生物蛋白水解第七章海洋动物水解蛋白

蛋白质经酸、碱或酶催化等方法水解，得到的产物称为水解蛋白或蛋白水解产物（proteinhydrolysate）。蛋白水解物有植物水解蛋白（HVP）和动物水解蛋白（HAP）两大类。海洋动物蛋白水解物营养丰富，而且具有良好的安全性和功能特性。广泛使用的蛋白质水解方法有化学方法与生物方法(酶法)，其中化学方法又包括酸水解法和碱水解法，虽然化学方法成本相对较低，简单易行，但是该法制备的水解物在食品工业应用有如下缺点：难以控制水解物的化学组成与功能性质；水解产物的营养性、功能性较差，丝氨酸、色氨酸等被破坏；色氨酸分解生成的吲哚基团，与水解物中糖类在酸性条件下生成的含醛基化合物缩合成腐黑质，使水解液变黑，因需脱色而使工艺繁杂；设备的耐腐蚀要求较高。相对于化学水解法，在食品工业中采用生物酶解法制备蛋白水解液有反应条件温柔，不会发生酸、碱水解过程中产生的外消旋反应，而且水解过程简单控制，从而控制产物性质等优点。本章主要介绍海洋动物蛋白酶解工艺和海洋动物蛋白水解物在水产调味料中的具体应用。

第一节海洋动物蛋白酶解工艺

一、工艺流程

典型的海洋动物蛋白水解物制造工艺流程如下所示：

原料预处理→加酶酶解反应→灭酶终止反应→分开→收集上清夜→脱腥、脱臭、脱色→浓缩→枯燥→海洋动物蛋白水解物

二、原料预处理

应选择少脂鱼类或者来自少脂鱼的原料作为酶水解的底物，以减少水解过程中及贮藏过程中脂类氧化引起的问题。其中鱼类中的中上层鱼大部分是多脂鱼，采用多脂鱼作为蛋白水解原料时，假使水解产物含有多于1%的脂肪，须用溶剂脱脂法脱去脂肪，或参与抗氧化剂，如丁羟基甲苯、丁羟基茴香醚等防止氧化。如：沙丁鱼碎鱼肉用异丙醇脱脂，溶剂:底物为1:1，46℃，30min脱脂三次。鲱鱼碎鱼肉直接用90%乙醇脱脂，鱼肉：乙醇为l:2，70℃，30min。用此法可使鲱鱼原料中脂类含量从4%降为0.9%。脂肪含量高的鱼蛋白水解物由于脂类氧化产生的羰基与蛋白质中的碱性基团发生缩合反应，形成褐色色素会使水解物色泽变暗。

三、酶解反应

酶水解法中关键的步骤是酶解，对于不同的原料，采用的具体酶解技术有组织酶自溶技术、自溶酶和外源酶相结合的技术、外源酶酶解技术。

1.组织酶自溶技术

水产动物体内存在着活性很高的水解酶(如类似胰蛋白酶、类似肠肽酶等)在一定条件下，往往会自发地对细胞结构组织起着协同一致的分解作用，但这种作用寻常比较缓慢而持久，这种对组织细胞的分解作用称为自溶作用

(Autolysis)。我国传统的鱼露、虾油等的生产实质上就是利用了鱼、虾组织中酶的自溶作用。利用组织酶的自溶作用可以改善食品原料的风味和质构，但是水产原料种类不同，其体内存在的水解酶的种类、含量、活力也不同，而且还会受到体内其它物质(自然的蛋白酶抑制剂)的影响。要充分发挥内源性组织酶的自溶作用就要破坏自然蛋白酶抑制剂的活性，目前的措施主要是采用热凝固法，但采用这种方法的同时也会使动物体内存在的自溶水解酶活性丧失。

2.自溶酶和外源酶相结合的技术

当利用自溶酶法达不到理想的效率或者风味不佳时，可以考虑添加一种外源蛋白酶进一步降解，使大分子蛋白质降解成小分子多肽或者氨基酸。例如利用虾头内源性蛋白酶与Alcalase2.4L、Flabourzyme外源酶混合的复合酶对虾头进行酶解，与用单一虾头内源蛋白酶酶解相比较，结果是外源酶与虾头内源蛋白酶复合使用后，能较大程度提高酶解产物中游离氨基酸的含量。

3.外源酶技术

蛋白质酶解工程是由肽链内切酶和肽链外切酶共同完成的。前者的水解产物为多肽，后者的水解产物为游离氨基酸，由于原料本身存在着肽链外切酶，所以靠添加内切酶或者再添加外切酶提高水解能力，不同的水解原料中的蛋白质种类和氨基酸构成比例各不一致，因此酶的选择和酶的水解条件也有明显的差异，外源酶技术可以分为单一酶解技术、双酶酶解技术和多酶复合酶解技术。

(1)单酶酶解技术单酶法是只用一种外源酶对原料中的蛋白质进行水解获得水解蛋白的方法。例如在提取烤鳗鱼下脚料的研究过程中，采用正交法优化各水解条件，确定了枯草杆菌中性蛋白酶为最正确，水解度可达82.6%，水解液具有鲜美的风味。

(2)双酶酶解技术单一酶对蛋白质的水解总是有限的，因此若选用对蛋白质底物酶解特异性有互补作用的两种酶，可以获得较好的水解效果。例如利用枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶两种外源酶水解翡翠贻贝并制作海鲜调味料，水解率可达82%。利用双酶法制备的水解水产动物蛋白液均具有味道鲜美、营养丰富的优点，是生产海鲜调味料的上佳材料。

(3)多酶复合酶解技术多酶复合法是用两种以上的酶对原料蛋白质进行水解的方法。例如汪涛等学者在对水解扇贝裙边的工艺进行研究时采用多酶复合酶解技术，先用混合内肽酶进行短时间水解，使蛋白质水解成肽段、结构变松散后升温灭酶，再添加风味蛋白酶（Flavourzyme）在其适合条件下进行其次阶段酶解，水解度可达68.2%，而且水解液具有贝类独特的鲜美风味。多酶法可利用

多种蛋白酶的作用专一性使原料蛋白质充分水解成氨基酸和端肽，产生的呈味氨基酸和肽会使水解液的味道更加鲜美，这种方法适合应用于制作海鲜调味料。

四、酶反应的终止

当酶解反应进行到一定程度，达到所需要的水解度后，必需终止酶反应。否则反应体系中的酶仍保持其活性，将进一步水解蛋白质和多肽，影响最终产物的功能和生理活性。酶解反应的终止可以采用化学法、加热法、化学法结合加热法。

1.化学法灭活

通过将酶水解反应物的pH调高或调低，使酶失活。将水解反应物的pH调理到中性能使木瓜蛋白酶以及其他大部分酸性蛋白酶失活。但是过高过低的pH对蛋白质和肽有不利的方面。大量蛋白质在pH约小于5或大于10时发生蛋白链的解开。

2.加热法灭活

寻常将水解物和酶的浆状物移入水浴中，在75～100℃的温度范围，加热5～30min，加热条件取决于酶的类型。对于耐热的蛋白酶需要延长加热时间和提高加热温度方法进行灭活。例如，木瓜蛋白酶是十分耐热的，据文献报道至少需要在90℃加热30min才能使之充分失活。用加热方法使酶失活虽然简单但是也有不利方面，如会使蛋白质发生热变性，导致疏水性基团的暴露并引起蛋白质的凝聚。鱼蛋白适于在低温下起作用，故其热稳定性一般都较差，过高及时间过长的加热处搭理导致蛋白质发生变性，变性会改变其物理化学性质，特别是易引起溶解度以及功能性的丧失。

3.化学法结合加热法

采用化学法结合加热法可以综合利用两种方法的优点，减轻单独使用一种方法的强度，从而更好地保持水解物的品质。在一定场合下，也可采用提高温度与降低pH相结合的方法。

五、酶解液的分开

将水解物浆液进行离心，除去淤渣，形成几个组分：底部是淤渣，中部是水溶液层，脂类——蛋白质组分在水溶液层与淤渣之间，顶部是水溶液/油层和清的油层。通过离心处理可除去大部分的脂类。将覆盖在水溶液表层的油层除去，便可收集可溶的部分。另外可以采用抽滤以及将水解浆液滤过2mm筛孔的滤网等方法实现水解液中可溶性组分与淤渣及脂类的分开。

六、水解蛋白的脱苦、脱腥及脱色

水产原料经过酶法水解后，最大的问题是水解液有异味，包括苦味、腥臭味等，水解液颜色深。

（一）苦味及其消除1.产生的原因

蛋白质水解后往往带有苦味，苦味来自于水解过程中产生的含疏水基团的短肽和疏水性氨基酸，其中，带有疏水基团的短肽比疏水性游离氨基酸的苦味大。短肽的苦味与其疏水基团的多少、种类及其排列顺序有直接关系。大多数苦味肽的链端都含有亮氨酸。氨基酸、肽和蛋白质的疏水性可用Q值度量，Q值代表氨基酸侧链从乙醇转移到水中的自由能的变化。人们可以由一种蛋白质的氨基酸组成，计算其Q值，并预计它产生苦味的倾向性。发现最苦的多肽，其Q值超过1400cal/mol，而不苦的多肽Q值低于1300cal/mol，这种肽的苦味与平均疏水性之间的经验的相关性，称为Q规律。但这规律只适用于分子量小于6000的多肽并且只有当肽链在纯溶液中尝味时才有效。蛋白水解物苦味的产生不仅与蛋白质的疏水性有关，而且与多种因素有关。

2.影响苦味程度的主要因素

（1）原料的选择和预处理原料的品质直接影响到水解蛋白的味道，水产品的种类不同，采用一致的水解方法得到的水解蛋白的味道也不同。

（2）疏水基团的位置疏水基团在链端时比在链内时产生的苦味少，因而水解时专一性蛋白酶的选择很重要。选择最适合的水解酶也可以控制苦味，常采

用对疏水性氨基酸优先攻击的酶，如Alcalase，能产生苦味较少的水解物。应用肽链外切酶而非肽链内切酶，有助于战胜鱼蛋白水解物的苦味，特别是采用那些能从苦味肽断裂疏水性氨基酸的肽链外切酶。

（3）水解度苦味与水解度之间有着十分密切的关系，水解度较低时，苦味肽的浓度低而且分子大，分子大的肽多呈U型或葡萄串形，疏水性侧链仍被隐蔽在内部，因而苦味较弱；当进一步降解成较小的肽时，苦味增加了。但是水解度很高时，小的苦味肽变成了疏水基在末端的更小的肽，甚至变成游离的氨基酸，所以苦味又逐渐减弱。水解度与苦味关系见图7-1。

图7-1苦味与DH的定性关系图7-2酶水解过程疏水区域的暴露

（黑色圆点代表疏水侧链）

图7-1中虚线所示为苦味的阈值，利用掩蔽(mashng)可明显提高阈值。蛋白质的水解导致隐蔽在内部的疏水性肽的暴露，它们能简单地和味蕾作用，使人感觉苦味。图7-2是酶解过程中疏水区域暴露的示意图。一般讲，分子量在1000～4000D的疏水性肽大都浮现苦味。

（4）pH调理剂当用苹果酸、柠檬酸、磷酸作为降低pH的试剂时，发现苦味比较弱