高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇含量及其药物代谢动力学

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课程平日考核

作业题目高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇含量及其药

物代谢动力学_____________________________

成绩

课程名称生物药剂学与药物动力学学院华西药学院考核序号1专业药学年级班级2023级2班学生姓名陈宇学号0845051028完成日期2023年5月18日

高效液相色谱法测定大鼠血浆中白藜芦醇含量

及其药物代谢动力学

DeterminationofResveratrolinRatPlasmabyHigh

PerformanceLiquidChromatographyandItsPharmacokinetics1试验目的

白藜芦醇(resveratrol，RES)化学名称为反-3，5，4’-三羟基-1，2-二苯乙烯(亦称芪三酚)，是重要的自然活性化合物[1]，是大量植物在受到真菌感染、紫外照射或病理状况下产生的-种多酚类植物抗毒素，目前已知7O多种自然植物中含有RES，主要存在于葡萄、葡萄汁、红酒及其他植物提取物中。现已证明RES具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗血小板聚集、调理免疫、保护肝脏及雌激素样作用[2]。目前，有文献报道采用现代仪器分析方法，如气相色谱-质谱、毛细管电泳和高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)测定酒或食物中的RES含量。大量体内与体外试验说明，RES具有广泛的生物学活性，但有关RES在大鼠体内的药物代谢动力学研究报道甚少。本试验建立高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)测定大鼠血浆中白藜芦醇浓度，并用该法研究大鼠静脉注射白藜芦醇后的药物代谢动力学，为该药的体内过程及应用提供理论和试验依据。

2材料

2.1试验动物

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，质量(180±20)g，合格证号为皖医实动准字01号，由安徽医科大学试验动物中心提供，试验前禁食12h，但可以自由饮水。1.2试验仪器

岛津高效液相色谱仪：包括LC-10AT泵、CBM-10Alite控制器、SPD-10Avp紫外检测器、CTO-10ASvp柱温箱、LC-Solution工作站；XW-80A微型旋涡混合器：上海医大仪器厂；TGL-l6GB台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂；BP211D型电子天平：德国Sartorius公司；JL-l8O超声仪。1.3药品与试剂

RES：成都兰贝植化科技有限公司，含量≥98%，批号081228；乙腈：色谱纯，天津市恒星化学试剂制造有限公司；甲醇：色谱纯，XX汉邦科技有限公司；

1

水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。

3方法

3.1色谱条件

色谱柱：ShimadzuVP-ODS(5μm，150mmX46mm)；滚动相：乙腈-水(35：65)；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：303nm；柱温25℃；进样量：20μl；灵敏度：0.001AUFS。3.2RES标准液

配制缜密称取RES5.0mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，使母液浓度为0.50mg/ml。并配制标准品相应系列的浓度、配制相应标准曲线及质控浓度。整个试验配制RES浓度过程是在室温避光条件下操作，该条件下分析样品中RES稳定性良好。3.3血浆样品采集

取SD雄性大鼠，试验前12h开始禁食不禁水，尾部静脉注射RES20mg/kg，于给药后5，10，30，60，90，l20，180，240，360，420min取血，置于肝素化试管中，12000r/min离心5min，分开血浆，即刻血浆样品经过相应处理后，采用HPLC对其进行分析。3.4血浆样品处理

取血浆200μm置于1.5mlEppendorf(EP)管中，参与400μl乙腈沉淀蛋白，于涡旋混合器上混匀3min后，12000r/min离心5min。取上清液20μl进样，峰面积外标法定量分析。

4考察参数及意义

4.1方法的专属性

在本色谱条件下，对空白血浆、对照品血浆及大鼠静脉注射RES5min后血浆样品进行HPLC分析。对HPLC色谱图进行分析，如样品色谱峰形良好，理论塔板数大于1000，血浆中杂质与RES分开良好（分开度>1.5），且杂质不干扰样品的测定，则该方法具有较高的专属性。4.2线性范围及最低检测限

在每20μl空白血浆中，分别参与RES系列标准品溶液，配制血浆中RES浓度分别为0.023，0.092，0.184，0.368，0.738，1.480，2.950，5.900，11.800和23.600μg/ml。按上述血浆样品处理步骤操作，并进行色谱分析。以RES标准对照品的峰面积(A)对相应的浓度(C，μg/m1)进行线性回归，得血浆标准曲线方程,标准差r，线性范围及本法测定血浆中RES的最低定量限。

2

4.3提取回收率和缜密度

用大鼠空白血浆配制浓度为0.092，0.738，11.800pg/ml低、中、高3种不同浓度的RES标准血浆样品，按上述“3.4〞项下方法处理，记录血浆样品中RES色谱峰面积记为Ax；同时，取200μl空白血浆于1.5mlEP管中，分别向其中参与400μl乙腈，涡旋3min，于12000r/min离心5min，移取上清液再分别向其中参与相应标准品储存液配制成相应的低、中、高3种浓度，于涡旋混合器上混匀3min后，于12000r/min离心5min，取20μl进样、分析、记录峰面积为As，比较上述两者峰面积，计算RES的提取回收率。同时测定日内和日间相对标准差。4.4血浆样品室温避光放置稳定性考察

在室温(25℃)避光放置10h，分别于0，2，4，6，8，10h按“3.4〞项下方法处理，代入当天的随行标准曲线，计算出低、中、高3种浓度的RSD。如实测浓度与参与浓度比值基本稳定，说明质控样品在室温避光条件下放置10h内稳定。

4.5RES在雄性大鼠体内的药物代谢动力学

取禁食但可以自由饮水的雄性大鼠，静脉注射RES(X0=20mg/kg)后，测得平均血药浓度-时间数据，以此计算静脉注射RES(20mg/k)后药动学参数。4.5.1根据二室模型计算

查阅相关资料，发现静脉注射白藜芦醇苷脂质体溶液，其分布消除符合二室模型[3]，即符合C=A?e-αt+B?e-βt通式，其中，α和β为混杂参数。

1、根据血药浓度-时间曲线消除相数据求β和B:以末端的血药浓度的对数对时间作图，即作lnC-t图，构成的直线，截矩为lnB，斜率为-β。

2、根据残数浓度Cr求α和A。以实测浓度C减去外推浓度C’得到外推浓度Cr，以lnCr-t作图即为残数线，其截矩为lnA，斜率-α。

3、消除半衰期（t1/2（β），血浆药物浓度或体内药物总量减少1/2，Half-Life）

所需时间，反映药物消除过程。消除快的药物t1/2短，消除慢的药物t1/2长。经5个t1/2后药物浓度下降到原来的3%左右，可认为基本消除完毕。根据该药的半衰期长短决定给药的间隔时间。对于肝、肾功能不好的患者来说，半衰期相对延长，如按常规给药，有引起中毒的危险。

t1/2（?）?0.693?

4、药物从中央室消除的一级速率常数k10

??k10?A?B

5、血药浓度-时间曲线下面积（AUC）

AUC0→420min指药物从零时间至420min这一段时间的药-时曲线下总面积AUC0→n=(1/2)(C1+C2)(t2-t1)+(1/2)(C2+C3)(t3-t2)+??+(1/2)(Cn-1+Cn)(tn-tn-1)

3

AUC0→∞指药物从零时间至所有原形药物全部消除这一段时间的药-时曲线下总面积，反映药物进入血循环的总量。

AUC0???

Cn1C?Ct?t????????a?1aaa?1?k2?106、总清除率（CL,Totalbodyclearance）单位时间内有多少毫升血中的药物

被清除，是正确估算药物从体内消除速度的唯一参数

CL=(X0)iv其中X0为静脉注射药量。

(AUC)iv4.5.2根据矩量估算药物动力学参数

1、平均滞留时间(MRT)平均滞留时间是导入机体的所有药物分子在体内停留的平均时间

一次给药将向机体输入众多药物分子。这些分子在体内停留不同时间，有的很快消除，有的则停留很长时间。其总体结果便是所有分子滞留时间的分布，故可用平均值加以表征。

MRT???0?tcdtcdt??0AUMCAUC

2、生物半衰期t1/2=0.693MRT3、清除率CL

(X0)iv(AUC)iv

4、稳态时的表观分布容积Vss，它是反映药物稳态特征的参数之一，与药物消除无关

CL=Vss?

X0XMRTAUMC??0AUCAUCAUC

5探讨

1.试验的优缺点

优点：本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中白藜芦醇含量及

其药物代谢动力学，与气相色谱-质谱（GC-MC）、毛细管电泳（CE）以及紫外分光光度法(UC)相比，有着高压、速度快、分析精度高、所需样本量少等优点。

4

缺点：

1)样品处理过程困难，需筛选适合的萃取方法。在大鼠血浆处理中，采用

乙醚液——液萃取法提取效率不高，而采用甲醇直接沉淀蛋白，离心后得到的上清液放置后有大量蛋白沉淀，不能完全地除去蛋白，虽然该法操作简便、经济、快速，但回收率低，且沉淀效果不如乙腈。故试验采用乙腈直接沉淀蛋白，血浆中参与2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率较高，操作简单、便利、效率高，符合生物药代动力学研究。

2)滚动相的筛选繁杂。有文献报道用甲醇：水(48：52)为滚动相[4]，经过

试验发现，此滚动相不能与杂质峰分开。经过滚动相配比及选择后确定采用乙腈：水(35：65)，可获得较短的保存时间，同时又可以与杂质峰分开。

3)检测波长的筛选繁杂。文献报道了280，306nm等多种检测波长[5]，本

试验通过波长扫描显示显示RES在303nm处有最大吸收峰，且干扰最小。2．试验能解决的问题

大鼠静脉注射RES后，可分别用二室模型和矩量求算t1/2、MRT、AUC、AUC0→∞、Vss和CL等药物动力学参数。这些药动学参数，有助于对RES客观药物评价，新药的能动设计、改进药物剂型、提供高效、速效、长效、低毒副作用的药剂，为了更好地评价RES的药用价值，对其在体内的代谢特点有待进一步的研究。

缺点：

1)样品处理过程困难，需筛选适合的萃取方法。在大鼠血浆处理中，采用

乙醚液——液萃取法提取效率不高，而采用甲醇直接沉淀蛋白，离心后得到的上清液放置后有大量蛋白沉淀，不能完全地除去蛋白，虽然该法操作简便、经济、快速，但回收率低，且沉淀效果不如乙腈。故试验采用乙腈直接沉淀蛋白，血浆中参与2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率较高，操作简单、便利、效率高，符合生物药代动力学研究。

2)滚动相的筛选繁杂。有文献报道用甲醇：水(48：52)为滚动相[4]，经过

试验发现，此滚动相不能与杂质峰分开。经过滚动相配比及选择后确定采用乙腈：水(35：65)，可获得较短的保存