J克隆DNA的分析与应用课件

J克隆DNA的分析与应用克隆的鉴定聚合酶链反应J1克隆的鉴定克隆的鉴定：现在对克隆进行部分或全序列的测定往往是第一步。虽然序列分析可提供推测基因的大小、限制图谱以及方向或者可读框（ORF），但仍须有实验证明推测基因确实在某生物体的一些细胞中转录成RNA，而对于那些编码蛋白的基因还要证明所预测大小的蛋白确实在体内被合成。

鉴定的内容：鉴定前需要纯化已克隆的DNA样品测定重组DNA分子的大小、限制图谱、基因的方向以及核苷酸的序列。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：

(1)Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。

(2)Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。DNA与RNA的杂交基因测序

PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获

J2聚合酶链反应（PCRpolymerasechainreaction）原理

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR的基本原理引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的基本原理第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理TaqTaqTaqTaq模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增原理：DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。首先是dsDNA在高温下变性成为ssDNA，然后DNA聚合酶以ssDNA为摸板，利用聚合酶和dNTPS合成新生的DNA互补链。新合成的dsDNA经过变性、复性、延伸。如此反复循环，使目标DNA以指数形式扩增。应用：扩增与分离目的基因；临床医疗诊断；胎儿性别鉴定；癌症治疗监控；基因突变与检测；分子进化研究；法医鉴定；商品检疫新药品的开发PCR反应组份模板引物（1对）Taq酶dNTP缓冲液（含Mg2+）聚合酶链反应(PCR)利用与DNA模板序列的两端互补的一对寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。由一种热稳定的DNA聚合酶经三步反应即变性、引物退火和聚合的循环从两个引物来相对延伸。

pre-denaturation--DenaturationannealingElongationcycles:25-30引物每一对PCR引物需18—30核苷酸，并且在一对引物间的G＋C含量相似，以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。对于短的寡核苷酸(＜25nt），退火温度(℃)可用下式计算：Tm＝2(A+T)+4(G+C)。如果PCR产物要用于克隆，最好在引物5’端加上单一的限制酶切位点。如果目的DNA序列是未知的，例如克隆一个只知道部分氨基酸序列的蛋白的cDNA，设计引物就会比较困难。因此可通过遗传密码解出编码已知氨基酸序列的DNA序列，再设计出简并引物。酶其中最常用的Taq聚合酶是从Thermusaquaticus菌中制备的。该酶能经受l－2min95℃变性步骤，在该温度下的半衰期大于2h。由于不具备3’－5’的校正外切酶活性，已知Taq酶在复制DNA时会引入错误，大约每聚合250nt发生一次错误。由于这一原因，常选用其他精度更高的热稳定DNA聚合酶用于某些特定的实验。如：Ex–Taq酶(TaKaRa)或pfu酶PCR循环：变性(94℃)、退火（50－60℃）、延伸（72℃）

PCRoptimization变性温度和时间92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加PCR污染及其对策强大扩增能力+检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等核酸酶S1作图法（亦称Berk-sharp作图法）S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。S1核酸酶可以降解单链DNA或RNA，而与mRNA杂交的DNA区段不被水解，可确定mRNA的末端以及位于其基因内部的内含子的位置。

引物延伸用反转录酶沿5’端向3’端方向延伸反义DNA引物，即从引物与目的序列配对处向聚合酶解离的模板末端延伸，然后将引物延伸的产物与能确定其长度的分子质量标记和(或)不同大小的序列共同电泳，可以测定出RNA分子的5'端。

研究基因表达的调控

（一）鉴定DNA分子上蛋白的结合位点当某一基因的转录产物的5’端被确定后，在基因组克隆上的相应位置就是转录起始点。DNA序列的上游含有控制基因时空转录的调控序列。转录因子与特异的调控序列相结合，并有助于转录起始。主要有两种方法：gelretardation（凝胶滞后）FootprintingwithDNaseI（DNaseI足迹法）

凝胶阻滞结合蛋白后，DNA的分子量将会增加，电泳过程中，迁移率将会下降，这种方法称为gelretardation（凝胶滞后）。可被用来检测与调控序列相结合的转录因子。

图6-22凝胶滞后原理

DnaseI足迹法

虽然凝胶阻滞能显示出蛋白与DNA分子的结合，但它并不能提供在所用片段中结合位点的序列，DNase足迹法可确定与蛋白作用的实际序列区域。用末端标记的DNA片段与蛋白样品(如核抽提物)相混合，待相互结合后，用DNaseI酶对复合物进行温和酶解，以期产生平均一个分子被切一次的产物。在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近DNA骨架，很难实现切割。将部分酶解的DNA进行PAGE电泳分析，在对照DNA的泳道中的梯状显示出所有随机的核酸酶切割部位，而在加入蛋白样品的泳道，显示出的梯状带中会有某些带的空缺。

DNA足迹分析技术可用于RNA聚合酶(蛋白质)结合序列的确定（二）通过deletion分析鉴定控制序列凝胶滞后和足迹试验可以定位控制序列，但不能研究其功能。Deletionanalysis(缺失分析)可以研究序列的功能。这种技术基于这样的原理：删除控制序列，可以改变克隆基因的表达调控方式。如基因的表达水平、组织特异性。

在删除控制区域之前必须寻找一种能检测缺失所带来的基因表达的变化，而且必须在原有生物体内这种研究才算准确，比如克隆到细菌中的植物基因必须在植物体内才能研究其调控方式。

报告基因的选择原则：首先它控制的是寄主生物体所没有的性状；报告基因必须容易检测；可以定量的研究。

如：lacZ,neo,cat,dhfr,aphlV,lux,uidA。报道基因

当控制转录的基因区域(启动子)经测序、S1作图和DNA－蛋白结合实验确定后，通常要将启动子接上报道基因对其功能进行研究，以验证该启动子所具有的特性。

怎样将克隆的基因与正常表达的基因区别呢？利用一个报告基因，克隆到控制序列的下游。当克隆到寄主体内后，报告基因将模仿原有基因的表达方式，因为它们是在相同的控制序列的调控之下表达的。

图6-24基因调控序列的结构

图6-25调控序列突变的结果J4克隆基因的诱变

缺失诱变

定点诱变

PCR诱变

缺失诱变

从一端开始渐渐缺失DNA对于确定特定序列的重要性是很有用的。用外切核酸酶III可从凹进的3’端沿3’向5‘方向移去一条链进行单向缺失，再用一种单链持