微生物学实验中药与制药

微生物学实验中药与制药第1页，共69页，2023年，2月20日，星期四目的要求:1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备

2、了解空气、皮肤细菌检查方法

3、掌握药品的微生物学检验程序和方法实验一药品的微生物限度检查（一）实验室常用消毒灭菌设备空气和皮肤细菌检查方法第2页，共69页，2023年，2月20日，星期四一.药品的微生物限度检查（一）1.口服药物的微生物检查:①大肠杆菌的检查：②细菌总数的检查2.外用药物的微生物检查:①绿脓杆菌的检查：②金黄色葡萄球菌的检查：

第3页，共69页，2023年，2月20日，星期四口服药外用药药品的微生物限度检查实验方法（一）

1.药品的预处理2克药品加20毫升生理盐水，研磨制成悬液

2.细菌培养外服药口用药药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中37℃,24小时37℃,24小时第4页，共69页，2023年，2月20日，星期四

将剩余口服药以10-110-210-310-4

进行稀释(以生理盐水稀释)

3.细菌总数测定加溶化的琼脂培养基中，混匀，冷却后,置37℃恒温培养箱培养24小时

。取三个中试管各管加9ml生理盐水从剩余10ml悬液中取1ml加入第一个稀释管中1ml10-110-410-210-39ml生理盐水从上述三个稀释管中各取1ml1ml10-110-410-210-3第5页，共69页，2023年，2月20日，星期四二.空气、皮肤细菌检查方法(验证)三.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：高压蒸汽灭菌锅消毒煮沸器G6玻璃滤菌器装置洁净工作台移动式紫外光灯鼓风式干烤箱紫外线杀菌标本。第6页，共69页，2023年，2月20日，星期四厌氧工作站催化剂（钯粒）厌氧培养罐电热恒温培养箱二氧化碳培养箱第7页，共69页，2023年，2月20日，星期四一、目的要求:1、了解细菌培养接种技术

2、掌握细菌基本形态

3、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（二）2.空气、皮肤细菌检查结果测定。3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。4.培养基的种类和用途普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基5.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能)

液体培养基 平板培养基 斜面培养基 双糖含铁半固体斜面培养基6.显微镜下观察

细菌的基本形态:球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。特殊结构：肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。实验二药品的微生物限度检查（二）细菌的形态学检查及培养接种技术第8页，共69页，2023年，2月20日，星期四一、空气、皮肤的细菌检查结果

1、记录空气微生物培养结果（要记录本人所在实验台的结果）菌落大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）2、记录皮肤微生物培养结果（要记录本人的实验结果）比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。第9页，共69页，2023年，2月20日，星期四二、培养基的制备培养基分类根据物理性状分类：液体培养基主要用于增菌半固体培养基用于检测动力及保存菌种固体培养基用于分离鉴定细菌根据用途分类：基础培养基普通琼脂培养基营养培养基血液琼脂培养基选择培养基SS培养基鉴别培养基双糖铁培养基厌氧培养基庖肉培养基第10页，共69页，2023年，2月20日，星期四培养基的制备程序调配→矫正pH（7.0-7.6）→分装→灭菌（121.3℃，20-30分钟）→放入冰箱冷藏备用。因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高。鉴定是否有菌可将培养基置于37℃培养24小时，然后观察。第11页，共69页，2023年，2月20日，星期四方法1.平板划线接种法（1）平行划线法（2）分区划线法2.琼脂斜面的接种方法3.液体培养基接种法4.半固体接种法第12页，共69页，2023年，2月20日，星期四平行划线法第13页，共69页，2023年，2月20日，星期四分区划线法第14页，共69页，2023年，2月20日，星期四菌落第15页，共69页，2023年，2月20日，星期四斜面移种技术第16页，共69页，2023年，2月20日，星期四菌苔第17页，共69页，2023年，2月20日，星期四液体移种技术第18页，共69页，2023年，2月20日，星期四穿刺技术第19页，共69页，2023年，2月20日，星期四取出前次实验培养物观察：

1.口服药物1)细菌鉴定：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：增菌液变混浊―――――有

-----接种在伊红美兰琼脂平板培养基上面。方法：分区划线接种。

2)细菌总数测定：选择30-300个菌落平板，细菌总数＝菌落数×稀释倍数药物的微生物限度检查方法（二）第20页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.外用药1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培养物有无细菌生长：增菌液变混浊―――有2)细菌鉴定：（1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上面。方法：斜面化线接种；（2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高盐琼脂平板培养基上面。方法：分区划线接种。

37℃恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。第21页，共69页，2023年，2月20日，星期四细菌基本形态球菌杆菌螺形菌第22页，共69页，2023年，2月20日，星期四葡萄球菌第23页，共69页，2023年，2月20日，星期四链球菌第24页，共69页，2023年，2月20日，星期四大肠埃希菌第25页，共69页，2023年，2月20日，星期四枯草杆菌第26页，共69页，2023年，2月20日，星期四霍乱弧菌第27页，共69页，2023年，2月20日，星期四细菌特殊结构鞭毛荚膜芽孢第28页，共69页，2023年，2月20日，星期四破伤风梭菌spore第29页，共69页，2023年，2月20日，星期四一、目的要求:1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察

2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察

1）液体培养基---沉淀、浑浊、表面生长现象。

2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。

3）双糖含铁培养基---动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。

4）结核杆菌菌落的观察。 3.中草药、抗生素抑菌试验

1）中草药---大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。

2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。实验三药品的微生物限度检查（三）微生物的形态学检查及药物的敏感性试验第30页，共69页，2023年，2月20日，星期四1）从伊红美兰琼脂平板培养基上-----

挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。

2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。

革兰氏染色镜下观察其菌落形态。根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的名称。

3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。药物的微生物限度检查（三）第31页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.细菌的生长现象及代谢产物的观察混浊生长菌膜菌沉淀均匀浑浊对照第32页，共69页，2023年，2月20日，星期四菌膜生长第33页，共69页，2023年，2月20日，星期四第34页，共69页，2023年，2月20日，星期四第35页，共69页，2023年，2月20日，星期四第36页，共69页，2023年，2月20日，星期四肠道杆菌双糖铁培养基结果比较葡萄糖乳糖硫化氢大肠杆菌副伤寒杆菌痢疾杆菌第37页，共69页，2023年，2月20日，星期四革兰染色步骤

1.制片：取标本（球杆混合物、牙垢）涂片、干燥、固定2.初染：结晶紫——1min——水洗3.媒染：碘液——1min——水洗4.脱色：95%酒精——30s——水洗5.复染：沙黄——1min—水洗、滤纸吸干6.油镜观察：第38页，共69页，2023年，2月20日，星期四第39页，共69页，2023年，2月20日，星期四1、制片

涂片、干燥、固定第40页，共69页，2023年，2月20日，星期四2.结晶紫初染1min——水洗第41页，共69页，2023年，2月20日，星期四3.碘液媒染1min——水洗第42页，共69页，2023年，2月20日，星期四4.95%酒精脱色30s——水洗第43页，共69页，2023年，2月20日，星期四5.沙黄复染1min——水洗、滤纸吸干第44页，共69页，2023年，2月20日，星期四第45页，共69页，2023年，2月20日，星期四6.油镜观察

结果革兰阳性菌：紫色革兰阴性菌：红色第46页，共69页，2023年，2月20日，星期四3.中草药、抗生素抑菌试验第47页，共69页，2023年，2月20日，星期四纸片法第48页，共69页，2023年，2月20日，星期四实验四药物的微生物限度检查（四）病毒和细菌及其他病原微生物一、目的要求1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1、药物的微生物限度检查（四）1）将口服药物中的细菌分别接种：①蛋白胨水培养基；②葡萄糖蛋白胨水培养基；③枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依据其反应结果,确定该菌的性质及名称。2、抗酸染色 3、真菌培养物的观察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，酵母菌菌落的观察。4、记录中草药、抗生素抑菌试验结果5、观察鸡胚的结构 第49页，共69页，2023年，2月20日，星期四生化反应管待检细菌对照菌(产气杆菌)蛋白胨水培养基2支管接种1支管接种1支管葡萄糖蛋白胨水培养基4支管接种2支管接种2支管枸橼酸盐培养基2支管接种1支管接种1支管接种细菌的对应生化反应管第50页，共69页，2023年，2月20日，星期四血浆凝固酶试验

玻片法第51页，共69页，2023年，2月20日，星期四抗酸染色原理:结核分枝杆菌含脂质多,不易着色,若加温或延长时间使其着色后,再用3%盐酸酒精处理也不易脱色,称抗酸染色.经此染色后,结核分枝杆菌呈红色,其它呈蓝色.

步骤２．抗酸染色第52页，共69页，2023年，2月20日，星期四制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸复红初染（加热、盖滤纸片）5min---水洗；3％盐酸酒精脱色（15S,水洗）；美兰复染（1min，水洗）-滤纸吸干镜检。抗酸染色步骤第53页，共69页，2023年，2月20日，星期四结核杆菌第54页，共69页，2023年，2月20日，星期四抗生素体外抑菌试验（二）

记录纸片法结果测量抑菌环直径

第55页，共69页，2023年，2月20日，星期四病毒的分离培养—鸡胚接种动物接种鸡胚培养组织细胞培养病毒的培养方法：第56页，共69页，2023年，2月20日，星期四病毒的分离培养—鸡胚接种第57页，共69页，2023年，2月20日，星期四病毒名称接种部位鸡胚胚龄（天）痘类病毒绒毛尿囊膜10～13流感、副流感、腮腺炎病毒尿囊9～11嗜神经病毒卵黄囊5～8初次分离标本羊膜腔10～12病毒的分离培养—鸡胚培养第58页，共69页，2023年，2月20日，星期四菌丝第59页，共69页，202