微生物学基本操作技术

微生物学基本操作技术第1页，共95页，2023年，2月20日，星期四内容微生物分类微生物接种和培养微生物的分离微生物的鉴定微生物保藏质控微生物第2页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类第3页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类-微生物的进化和多样性普遍性系统发育树,亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。G.J.OlsenandC.R.Woese,‘RibosomalRNA:AkeytoPhylogeny’intheFASEBJournal,7:113-123,1993第4页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类原核生物大小:0.5-3mm形状:-球型(Sthaphylococcus)-棒状(Escherichiacoli)-螺旋(Rhodospirillum)生长迅速，20min至几小时可繁殖一代可利用多种碳源

真核生物细胞器：线粒体内质网高尔基体液泡第5页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类/cells/animals/images/animalcell.jpg/cells/procaryotes/images/procaryote.jpg第6页，共95页，2023年，2月20日，星期四原核生物一、微生物分类第7页，共95页，2023年，2月20日，星期四真核生物一、微生物分类第8页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类-多相分类表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相分类PolyphasicTexonomyTechnology第9页，共95页，2023年，2月20日，星期四一、微生物分类-微生物的分类等级“种”是微生物分类中最基本的分类单元。“种”的定义：一个种（基因型种）是有相似G+C组成并通过DNA杂交试验判断由70%或更大相似性的菌株的集合。分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）第10页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养第11页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养微生物接种定义将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。接种工具

微生物接种技术分类斜面接种液体接种穿刺接种平板接种

第12页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧；接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。第13页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养第14页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养液体接种操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；塞上棉塞，轻轻摇动均匀；如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。第15页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养第16页，共95页，2023年，2月20日，星期四三、微生物接种和培养穿刺接种用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出；此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。第17页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养第18页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养平板接种平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等；平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；斜面接平板：点种法、划线法。第19页，共95页，2023年，2月20日，星期四二、微生物接种和培养第20页，共95页，2023年，2月20日，星期四三、微生物分离第21页，共95页，2023年，2月20日，星期四微生物纯培养分离技术纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。获得纯培养物对微生物学研究至关重要。第22页，共95页，2023年，2月20日，星期四微生物纯培养分离技术涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离法单细胞（孢子）分离法选择培养基分离法第23页，共95页，2023年，2月20日，星期四涂布平板法1、少量样品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。第24页，共95页，2023年，2月20日，星期四涂布平板法样品需适当稀释30-300CFU/mL第25页，共95页，2023年，2月20日，星期四平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法第26页，共95页，2023年，2月20日，星期四平板划线法斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。第27页，共95页，2023年，2月20日，星期四平板划线法血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）第28页，共95页，2023年，2月20日，星期四平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。第29页，共95页，2023年，2月20日，星期四稀释摇管法适合厌氧菌的纯培养分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右梯度稀释后的待分离菌株加入试管中摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后，菌落形成在琼脂柱的中间第30页，共95页，2023年，2月20日，星期四液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

第31页，共95页，2023年，2月20日，星期四单细胞（孢子）分离单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。第32页，共95页，2023年，2月20日，星期四选择培养基分离选择培养基特性促生长能力抑制能力指示（鉴别）能力第33页，共95页，2023年，2月20日，星期四选择培养基分离传统选择性培养基血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。第34页，共95页，2023年，2月20日，星期四选择培养基分离新型显色培养基利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。OrganismEnzymeSubstrateColorColiformsβ-galactosidaseX-GALBlueEscherichiacoliβ-galactosidase

β-Glucuronidase

MUGfluorescenceEscherichiacoliO157β-galactosidaseX-GALBlue第35页，共95页，2023年，2月20日，星期四选择培养基分离第36页，共95页，2023年，2月20日，星期四基于酶与底物反应的显色培养基技术CHROMagar第37页，共95页，2023年，2月20日，星期四Petrifilm3MAerobicCountPlateColiformCountPlateRapidColiformCountPlateE.coli/ColiformCountPlateEnterbacteriaceaeCountPlateYeastandMoldCountPlateStaph.aureusExpressCountPlateEnvironmentalListeriaPlate基于酶与底物反应的显色培养基技术第38页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定第39页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定多相鉴定（分类)（polyphasictaxonomy）是利用微生物从分子特性到生态特征的多种不同信息，综合表型和基因型特征进行微生物分类鉴定的方法。第40页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-形态学观察细菌酵母丝状真菌宏观形态（培养特征）将培养物划线或稀释涂布，30℃培养16~24小时，选取划线或稀释涂布分离得到单菌落，观察和记录菌落的形状、大小、质地、边缘、颜色、光泽、透明度、隆起等。将培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25℃培养2～3d后，进行菌落形态观察，菌落质地、菌落颜色、菌落表面是否为反光或暗淡、菌落是平伏还是隆起、菌落边缘等。标准培养基（CA、CYA、WA）平板倒转，向上接种三点，每个菌株接种两个平板，倒置于

25℃温箱中进行培养7天。观察菌落直径、颜色、质地、渗出液、菌落反面颜色等特征。微观形态（细胞特征）将培养物在30℃条件下培养16~24小时，挑取对数期的单菌落，涂布于事先滴加少量无菌水的载玻片上，自然干燥，加热固定，进行革兰氏染色，将制好的染色涂片在100X40倍的显微镜下观察革兰氏染色情况、菌体形状、排列行状、菌体大小等细胞特征。培养物划线接种于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25℃培养2～3d后，取酵母菌制作成水浸片，在显微镜下观察细胞形态和无性繁殖方式等。用无菌接种针挑取少量培养物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，用接种针将菌丝团分散开，盖上盖玻片（勿使产生气泡），制成水浸片，显微镜下观察菌体形态特征，包括分生孢子梗、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗、产孢结构、分生孢子头、分生孢子等。第41页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-形态学观察第42页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-生理生化碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物第43页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-生理生化Divisionbasedonmembranecomposition:a)gram-negative–haveouterandinnermembranesand athincellwall(Escherichiacoli)b)gram-positive–havenooutermembrane,buthavea thickercellwall(Bacillussubtilis)c)neithergram-norgram+-nocellwalls(mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg第44页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-生理生化API(bioMerieux)(biochemical)第45页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-生理生化BBLCrystal(BectonDickinson)将传统的生化反应、酶—底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。六类鉴定试验板，可鉴定500种细菌第46页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-化学成分分析第47页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-基因型分析G+Cmol%16SrDNA,26SrDNAD1/D2,5.8SrDNAITSregion,β-tubulingene,calmodulingene,gyrAgene,pheSgene,recNgene,rpoBgeneandotherhousekeepinggenes.DNABarcodinggenesequenceanalysis,MultiLocusSequenceAnalysis(MLSA)DNA-DNA

hybridizationRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,LAMP.第48页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-基因型分析DNA指纹图谱分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCPERIC－PCR以细菌DNA中串联重复序列为引物，通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，应用于菌株分型。BOX-PCR根据BOX插入因子(大小为154bp,由保守性不同的boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)等亚单位组成)设计引物,扩增微生物基因组DNA的重复性片段,最后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性。REP-PCR扩增细菌基因的重复DNA片段来获得菌株特异性遗传图谱,其中重复DNA片段包含了一个高度保守的回文序列(REP)为38bp的片段,由1个保守回文段以及两端分别有6个降解位点和1个5bp的可变框构成。PCR-SSCP是聚合酶链式反应与单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合，利用不同构象单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异,检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变,现已广泛应用于各种基因多态性的研究。。假丝酵母PCR-SSCP副溶血弧菌ERIC－PCR沙门氏菌REP-PCR第49页，共95页，2023年，2月20日，星期四四、微生物鉴定-鉴定实例116SrDNA序列系统发育树infB基因序列系统发育树第50页，共95页，2023年，2月20日，星期四2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新种发表2008年ATCC16404鉴定为

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP将ATCC16404更名

2010年WDCM将ATCC16404更名

图：ATCC16888和ATCC16404的培养特征和显微形态a´nosVarga,Sa´ndorKocsube´,Bea´taTo´th,etal.Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistribution.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932图:Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台)Figure2:DendrogramofRep-PCRBarcoding(DiversiLabPlatform).注：图片来源于ReclassificationofATCC®16404TMandATCC®9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14表

ITS序列特殊位点碱基差异TableDifferenceofbasepositioninITSsequence四、微生物鉴定-鉴定实例2第51页，共95页，2023年，2月20日，星期四2007年Aspergillusbrasiliensissp.nov.新种发表2008年ATCC16404鉴定为

Aspergillusbrasiliensis

sp.nov.

2010年USP将ATCC16404更名

2010年WDCM将ATCC16404更名

图:基于曲霉黑色组β-微管蛋白基因序列的N-J树Figure:Neighbour–joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri..注：图片来源于Aspergillusbrasiliensissp.nov.,abiseriateblackAspergillusspecieswithworld-widedistributionInternational.JournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2007,57:1925–1932图1:基于ITSDNA序列的黑色曲霉N-J树Figure1:ANeighborJoiningTreeofBlackAspergillibasedonTheirITSDNASequences.注：图片来源于ReclassificationofATCC®16404TMandATCC®9642TMasAspergillusbrasiliensis.PharmaceuticalMicrobiologyForumNewsletter,2008,Vol.14(10):2-14四、微生物鉴定-鉴定实例2第52页，共95页，2023年，2月20日，星期四各种标准中仍将继续采用ATCC16404作为质控菌株。各类标准中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F)98003)

,需要重新复核鉴定。黑曲霉？四、微生物鉴定-鉴定实例2第53页，共95页，2023年，2月20日，星期四形态学鉴定CYA培养基,25°C培养7dBiolog鉴定生长浊度试验ITSrDNA区序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3β-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3反应体系：100μL,10×扩增缓冲液10μL;DNA模板1μL;dNTP(每种2.5mmol/L)8μL;引物(10μL/L)各2.5μL;TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)1.3μL;无菌超纯水补足总体积100μL。反应程序：94°C5min;94°C1min,55°C1min,72°C1min,30个循环;72°C10min,4°C保存。四、微生物鉴定-鉴定实例2第54页，共95页，2023年，2月20日，星期四形态学鉴定图

25°C培养7d菌种的宏观形态和显微形态FigMacromorphologyandmicromorphologyon25°C,7d注:A菌落形态;B:分生孢子梗形态(×100);C:分生孢子形态(×400).Note:A:Colonymorphology,B:Conidiophoremorphology(×100);C:Conidialmorphology(×400).该菌株的形态学特征符合黑曲霉A.niger的形态特征四、微生物鉴定-鉴定实例2第55页，共95页，2023年，2月20日，星期四Biolog鉴定注:−:没有生长;+:生长旺盛;w:微弱(边界)生长;v:可变.Note:−:Nogrowth;+:Stronggrowth;w:Weakgrowth;v:Variedgrowth.表

碳源利用情况TableCarbonSourceUtilization碳源CarbonsourceATCC16888AspergillusnigerATCC16404AspergillusbrasiliensisCMCC(F)98003麦芽糖Maltose+−+β-甲基-D-葡萄糖苷β-Methyl-D-Glucoside+−+D-海藻糖D-Trehalose+−+L-苹果酸L-MalicAcidv+−α-酮戊二酸α-Ketoglutaricacid−w−苦杏仁苷Amygdalin+−+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鉴定-鉴定实例2第56页，共95页，2023年，2月20日，星期四ITSrDNA区序列分析图

CMCC(F)98003的ITSrDNA区序列和β-微管蛋白基因序列PCR扩增结果FigITSrDNAandβ-tubulingenePCRamplificationresultsofCMCC(F)98003注:M:DL2000marker;1:ITSrDNA区PCR扩增结果;2:β-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note:M:DL2000marker;1:ITSrDNAPCRamplificationresult;2:β-tubulingenePCRamplificationresult.表

ITS序列特殊位点碱基差异TableDifferenceofbasepositioninITSsequence碱基位点Baseposition140166172173AspergillusbrasiliensisIMI381727CCTCAspergillusnigerATCC16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点.Note:ThefirstCinthebordersequence(TTACCG)of18SandITS1isheredefinedasposition1.四、微生物鉴定-鉴定实例2第57页，共95页，2023年，2月20日，星期四ITSrDNA区序列分析以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点。140166172、173四、微生物鉴定-鉴定实例2第58页，共95页，2023年，2月20日，星期四ITSrDNA区序列分析图

基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树FigANeighborJoiningTreeofAspergillussectionNigri.basedonTheirITSDNASequences注:图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003与与A.nigerATCC16888聚类在分类距离最近的一个分支上,序列相似性达100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%−100%之间。四、微生物鉴定-鉴定实例2第59页，共95页，2023年，2月20日，星期四β-微管蛋白基因序列分析图

基于β-微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树FigNeighbour-joiningtreebasedonβ-tubulinsequencedataofAspergillussectionNigri注:图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbersabovebranchesarebootstrapvalues.Onlyvaluesabove50%areindicated.Bar,geneticdistance.CMCC(F)98003与黑曲霉A.nigerCBS554.65T序列同源性为100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。结合形态学、碳源利用情况和ITSrDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果,将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger

）。四、微生物鉴定-鉴定实例2第60页，共95页，2023年，2月20日，星期四五、微生物保藏第61页，共95页，2023年，2月20日，星期四菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。

《中国微生物菌种保藏管理条例》五、微生物保藏第62页，共95页，2023年，2月20日，星期四制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。五、微生物保藏第63页，共95页，2023年，2月20日，星期四微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。五、微生物保藏第64页，共95页，2023年，2月20日，星期四常用菌种保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法第65页，共95页，2023年，2月20日，星期四定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏第66页，共95页，2023年，2月20日，星期四

斜面制备培养基配制分装灭菌摆放斜面第67页，共95页，2023年，2月20日，星期四

接种第68页，共95页，2023年，2月20日，星期四培养细菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d丝状真菌26℃，5~7d保藏4~6℃保藏3~6个月

培养和保藏第69页，共95页，2023年，2月20日，星期四定期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。第70页，共95页，2023年，2月20日，星期四液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。第71页，共95页，2023年，2月20日，星期四

操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保藏优质化学纯液体石蜡灭菌：

—121℃湿热灭菌30min，蒸发水分；

—160℃干热灭菌2h；冷却至室温。液面高出斜面顶部1cm4～6℃，干燥处；直立放置；保藏时间1～2年。第72页，共95页，2023年，2月20日，星期四液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·菌种易退化、污染。第73页，共95页，2023年，2月20日，星期四真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。第74页，共95页，2023年，2月20日，星期四安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌

121℃，30min.第75页，共95页，2023年，2月20日，星期四保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天，无菌检查合格后备用。

第76页，共95页，2023年，2月20日，星期四冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。第77页，共95页，2023年，2月20日，星期四真空干燥

在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结第78页，共95页，2023年，2月20日，星期四预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。第79页，共95页，2023年，2月20日，星期四熔封

将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。第80页，共95页，2023年，2月20日，星期四真空度检测

用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。

第81页，共95页，2023年，2月20日，星期四保藏

4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。

第82页，共95页，2023年，2月20日，星期四真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。第83页，共95页，2023年，2月20日，星期四-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备保护剂（10%-15%甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（-80℃，2～5年）第84页，共95页，2023年，2月20日，星期四Microbank第85页，共95页，2023年，2月20日，星期四-80℃冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80℃冰箱)；运输不方便。第86页，共95页，2023年，2月20日，星期四液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。第87页，共95页，2023年，2月20日，星期四操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻

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将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃；

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使用程序降温盒。保藏

将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相