免疫组化各步原理

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry;IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。Slide3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10min→二甲苯Ⅱ5~10min→无水乙醇5min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→自来水洗Slide6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS洗3次，每次5min。3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃Slide7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，Slide8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。抗原修复；PBS洗3次，每次5min；Slide11:滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次3min。擦干组织周围PBS，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃,孵育20min。PBS洗3次，每次3min，D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。（四）抗原修复:（四）抗原修复目的：1、甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原决定簇。4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结合。Slide15:抗原修复的作用机理是1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。3、微波是一种高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。Slide16:抗原修复注意事项:抗原修复注意事项1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。2、热处理后应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。3、防止切片干燥，特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。Slide22:4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变；热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。Slide23:（五）常用溶液的配制1、0.01MPBS:磷酸二氢钠(NaH2PO4)1.5g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)14.5g氯化钠42.5g氢氧化钠2粒加蒸馏水5000mlSlide24:2、3%H2O2甲醇450ml30%H2O250ml混匀。Slide25:3、pH值6．0的柠檬酸缓冲液3.1储存液：A液：枸橼酸21.01g蒸馏水1000mlB液：枸橼酸钠29.41g蒸馏水1000mlSlide26:0.13.2工作液：A液9mlB液41ml蒸馏水450ml溶液pH值为6.0Slide27:4、胰蛋白酶(0.05%~0.1%)取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.1%pH7.8的无水氯化钙水溶液中溶解即可。Slide28:5、胃蛋白酶（0.4%）胃蛋白酶0.4克0.1mol/LHCl100ml*配制好的酶用5ml小瓶分装，保存于冷冻箱，用前拿出来溶解。（六）结果观察(一)胞浆阳性:（六）结果观察(一)胞浆阳性(二)胞核阳性:(二)胞核阳性Slide31:二、常见问题及对策Slide32:由于免疫组化染色过程有许多步骤和环节，每一个步骤和环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件很容易的事，需要病理技术员和医生密切配合，共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。根据我们多年的经验，发现目前，免疫组化制片过程中常见的问题主要有如下几点：Slide33:常见问题1、组织的前期处理2、脱片问题3、阴性片4、背景染色Slide34:（一）组织的前期处理要规范固定：新鲜标本一定要及时固定，离体后30min内固定,大标本需切开固定（以防止组织内自溶，抗原被破坏），固定时间不要浆阳性非常相似（图4）。解决办法是用鸡蛋清封闭或采用非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision）可避免生物素干扰。Slide59:三、

抗体的保存储存抗体的容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。我们使用的绝大多数抗体都是从公司购买的已稀释的即用型抗体，应保存在4－8℃冰箱中，并注意其有效日期。Slide60:浓缩型抗体一般应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融，冷冻的抗体溶解时应缓慢地解冻，绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体会出现假阳性，应防止细菌污染。Slide61:四、病理科建立免疫组化室需要的基本设备空调；切片机；漂片烤片机；冰箱（4℃.-18℃）；恒温干燥箱；37℃隔水式恒温箱；微波炉;高压锅；电磁炉孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架；Slide62:1000ul、100ul、10ul移液器和配套的tip头；PAP油性笔；定时器；放水瓶；错层实验台。免疫组化自动染色仪。脱落细胞制片技术:脱落细胞制片技术基本程序：1、编号：申请单、登记本、标本、玻片2、登记姓名、标本来源、临床诊断3、制片：主要介绍痰液、尿液、胸腹水标本的制作4、诊断一、痰液标本的采集与涂片:一、痰液标本的采集与涂片采集方法：清晨空腹时，先嘱病人将口内唾液吐出，再嘱病人从肺部深处用力咳嗽，咳痰3~6口，总量5ml左右，置于痰杯或厚纸盒内，连续送检3天，每天一次；痰液标本必须新鲜，最好在1小时内涂片固定。Slide65:选材涂片1、一般选取血丝及其附近；鲜血旁的粘液；灰白、细丝线样痰丝；透明痰液有时也有很多癌细胞。2、血块、脓块、灰黑色胶冻样颗粒和泡沫等常无癌细胞，选材时应将其除去。3、涂片：一般涂2张，用细竹签或眼科镊将其拉平或将2张玻片推拉，厚约1mm，不能太厚，也不能太薄。自然凉干或用冷风吹干固定。二、胸腹水、尿液标本的涂片:二、胸腹水、尿液标本的涂片1、临床送检的胸腹水、尿液标本一般有500ml左右，先将标本静置10分钟，轻轻倒出上清液，保留底部沉淀约20~40ml；2、将底部沉淀摇匀，加入2支10ml的离心管内（尿液标本需4支离心管），经天平平衡，放入离心机内，以每分钟1000~2000转的速度离心10min;Slide67:3、取出离心管，将上清液全部倒去，留0.5ml左右的管底沉淀和剩余液体（尿液标本因细胞少，要尽量吸干上清液将几管的细胞混在一起涂片）；4、用吸管吸取红细胞与上清液之间的白膜层，置于干净涂片上，每个标本均匀涂片2张，凉干或用冷风吹干固定。三、涂片制备注意事项:三、涂片制备注意事项1、动作要轻：避免人为损伤细胞。2、厚薄要适宜：涂片太厚，细胞重叠，不利于镜检；涂片太薄，细胞太少，容易漏诊。3、防止细胞脱落：对蛋白含量少的标本（如尿液标本）细胞不易于黏附在玻片上，染色过程中细胞容易脱落，应先在玻片上涂抹蛋白甘油以防细胞脱落，再涂标本。四、固定:四、固定常用固定剂1、95%酒精：最常用，方便2、乙醚酒精：渗透性强，固定效果好95%酒精49.5ml乙醚49.5ml冰醋酸1ml固定时间：一般需15~30分钟五、常用染色方法及步骤:五、常用染色方法及步骤苏木素—伊红（HE）染色法1、涂片固定10~30min后，自来水洗；D.w洗2、浸入苏木素染液中染5~10min,水洗1min3、0.1%的盐酸酒精分化数秒钟，水洗4、饱和碳酸锂返蓝1~2min，水洗10min5、伊红染1~2min6、70%、80%、95%、无水酒精各脱水1min7、吹干，中性树胶封片，贴标签瑞氏染色法六、胸腹水脱落细胞快速制片法:六、胸腹水脱落细胞快速制片法1、收集细胞：用细胞采集器收集。先将注射器与三通锥管紧密连接，然后将带有浓缩器一端的软管置于待检标本中，另一端置废液缸，缓慢均匀地反复抽推注射器，至感到抽吸吃力或抽完为止。Slide72:2、涂片：打开浓缩器，取出过滤膜片，将膜片有细胞的一面与用多聚赖氨酸处理的载玻片很好地接触，将细胞均匀黏附于载玻片上，冷风吹干。Slide73:3、固定