(4.8)-第五章酶分子修饰

吸附法交联法包埋法物理吸附生物吸附离子吸附酶的固定化纤维凝胶半透膜共价结合法利用物理吸附法对酶进行固定化主要通过

结合于载体上。氢键、疏水作用和π-电子亲和力氢键、离子键和π-电子亲和力氢键、离子键和共价键离子键、疏水作用和共价键ABCD提交单选题1分酶固定化后，受载体带电性和产物性质的影响，其最适pH和酶活力-pH曲线常发生偏移。一般来说，用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH较游离酶

；当催化反应的产物为碱性时，固定化后酶的最适pH值较游离酶

。升高

升高降低

降低升高

降低降低

升高ABCD提交单选题1分吸附法包埋法共价交联法细胞的固定化载体固定化法无载体固定化法絮凝法物理法共价交联法第五章酶分子修饰Chapter5ModificationofEnzymeMolecule限制酶大规模应用的原因1.易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2.容易受产物和抑制剂的抑制，易被蛋白酶降解；3.酶做为药物免疫原性强，体内半衰期短；4.已知酶种类及产物有限。1.通过分子修饰方法来改变已分离出来的天然酶的活性。——蛋白质水平（化学酶工程）2.通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。——核酸水平（生物酶工程）改变酶特性的两种主要方法：

酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的技术过程。酶的活性中心酶分子修饰的发展酶分子修饰的种类修饰酶的性质酶分子修饰的应用主要内容一、活性中心（activecenter）的概念酶分子中的一小部分区域——

由酶分子中少数氨基酸残基参与组成与底物发生结合和催化作用与酶活力直接相关第一节酶的活性中心二、酶活性中心的共性Theactivesiteformedby

essentialgroups

istheregionoftheenzymethat

bindsthesubstrate,to

formanenzyme-substratecomplex,and

transformsitintoproduct.1.酶的活性中心是由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域，其构象不是固定不变的（诱导契合）。2.活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。3.活性部位是一个三维实体。Theactivesiteisoftena

cleft

orcrevice

onthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundby

multipleweakinteractions.4.活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。5.酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。下列关于酶活性部位的描述错误的一项是

。活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催化功能的部位活性部位的基团按功能可分为两大类：一类是结合基团，一类是催化基团酶活性部位的基团可以是同一条肽链但在一级结构上相距很远的基团不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位ABCD提交单选题1分1.物理学方法2.化学修饰法3.动力学参数法4.蛋白质工程

三、研究酶活性中心的方法1.化学修饰法根据所用修饰试剂不同，分为:1)非专一性化学修饰

用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。2)专一性化学修饰用专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。

基团专一性修饰：用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的某一特定氨基酸残基的侧链基团。若修饰后：

酶活性不变——修饰基团不是酶的必需基团

酶活性降低或丧失——修饰基团可能是酶的必需基团，但不能确定是否位于活性中心内

位点专一性修饰(亲和标记）：利用酶对底物的特殊亲和力修饰酶分子活性中心的某一特定氨基酸残基的侧链基团。化学修饰的专一性

亲和修饰剂特点：①与底物结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。亲和标记（位点专一性修饰）2.蛋白质工程将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。一、研究酶的结构与功能的关系（上世纪50年代）探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测第二节酶分子修饰的发展二、人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围（上世纪70年代）提高酶的生物活性（酶活力）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）产生新的催化能力三、获得新酶（上世纪80年代）

定点突变、PCR技术等第三节酶分子修饰的种类一、金属离子置换修饰二、酶分子的化学修饰三、酶分子的物理修饰一、金属离子置换修饰（metalionsubstitutemodification）

将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离子，使其催化特性发生改变的修饰方法。1.方法：

酶的分离纯化除去原有金属离子：加入金属螯合剂，去除螯合物

加入置换离子2.作用：阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶的催化效率增强酶的稳定性改变酶的动力学特性1.酶分子表面化学修饰（氨基酸数量、种类不变）（1）大分子结合修饰（2）侧链基团修饰（小分子修饰）（3）交联修饰（4）固定化修饰（共价结合法）2.酶分子内部修饰（氨基酸数量、种类改变）（1）肽链有限水解修饰/核苷酸链剪切修饰（2）氨基酸置换修饰/核苷酸置换修饰二、酶分子的化学修饰1.酶分子表面化学修饰（1）大分子结合修饰（macromoleculescombinemodification）

利用水溶性大分子与酶的侧链基团结合，使之在酶的表面形成一覆盖层，从而改变酶的催化特性的方法。

修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、糖肽（glycopeptide）、肝素（heparin）、白蛋白等。

修饰方法：修饰剂选择，修饰剂活化，修饰，分离（凝胶层析）。①聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇（PEG，Mw5000-20000）：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性。单甲氧基聚乙二醇（mPEG）：

CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OHmPEG活化方法：重氮法、叠氮法、烷基化法例：聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（SOD）：生物体内重要的自由基清除剂，催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应，能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护。缺陷：半衰期短（6min）、稳定性差、免疫原性强！改进方法：mPEG修饰修饰剂选择：单甲氧基PEG(mPEG)修饰剂活化：烷基化修饰：活化后的修饰剂与蛋白上赖氨酸残基的ε-氨基或N末端氨基反应，形成稳定的连接体分离：分子筛层析效果：抑制免疫反应的产生，提高抗酶水解能力，延长半衰期（35h）原因？？修饰原理抑制免疫反应产生：PEG与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成一个PEG保护层，破坏或者作为屏障挡住蛋白分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原和抗体的结合。抗酶水解能力提高：保护层的形成屏蔽了水解酶的作用位点，保护其免受体内水解酶的消化。半衰期延长：蛋白经PEG修饰后分子量增加，分子的体积增大，肾小球过滤减少，可以避免被肾脏很快地排除，因而其血浆存留时间得到显著延长，有助于蛋白药物循环。-NH2②糖类的修饰反应：右旋糖苷修饰反应右旋糖苷：-葡萄糖通过-1,6-糖苷键连接而成，双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。糖肽（Glycopeptide）的修饰反应:

糖肽：人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。修饰方法：异氰酸法、戊二醛法。聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的活化剂可与酶分子上氨基反应。③其他合成大分子多聚物的修饰反应(1)聚N-乙烯吡硌烷酮（PVP）:用水溶性的分子量为10,000的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。(2)聚乙烯醇（PVA）:PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。(3)聚丙烯酸（PAA）:用分子量为250,000的PAA，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。(4)聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。(5)聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。④天然大分子对酶的修饰反应肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性。修饰方法：烷基化法、溴化氰法④天然大分子对酶的修饰反应人血清白蛋白：包含585个氨基酸，分子量为66kD

临床应用：治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂修饰方法：戊二醛法、活性酯法A.提高酶的催化效率部分水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合后，一定程度上改变了酶的空间构象，有利于活性中心与底物结合并发挥催化作用⑤大分子结合修饰的作用

增强酶天然构象的稳定性与耐热性——修饰剂与酶形成多点交联，使酶的天然构象“刚性”增加。

保护酶活性部位与抗抑制剂——大分子修饰剂产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂。

维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶——大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶；敏感基团交联上修饰剂后受蛋白水解酶破坏的可能性减小。

稳定酶的微环境——大分子修饰剂（多聚电荷体）在酶分子表面形成“缓冲外壳”B.增强酶的稳定性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。

破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除

遮盖了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合C.降低或消除酶蛋白的抗原性⑥大分子结合修饰的应用

PEG-超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）

PEG-溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase,SK;尿激酶urokinase,UK等）

PEG-天冬酰胺酶（Asparaginase,ASNase）消除了抗原性延长了酶在体内的半衰期用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。（2）侧链基团修饰（小分子修饰）（sideresiduesmodification）通过小分子化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、羟基、咪唑基等。

20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰。

侧链基团修饰剂：小分子化合物在构成酶的20种氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。其中，酶分子侧链上的巯基和咪唑基主要由

提供。Cys和Tyr

Trp和HisCys和HisHis和CysABCD提交单选题1分烷基化反应酰基化反应氧化还原反应芳香环取代反应①几种重要的修饰反应烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的活性基团发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys），胍基（Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），咪唑基（His）。修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反应酰基化反应试剂特点：通常含有结构，作用于侧链基团上的活性基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等酰基化反应氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。还原剂：2-巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。芳香环取代反应试剂：卤（碘）化、硝化试剂

（四硝基甲烷）I2++HI(NO2)4C+

+(NO2)3CH②特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰氨基的化学修饰：来源：Lys、N端氨基修饰反应：酰基化、烷基化修饰剂:

三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯碘乙酸Lysε-氨基专一性修饰剂羧基的化学修饰来源：Asp、Glu修饰反应：烷基化修饰羧基的反应专一性较差。修饰剂：碳二亚胺+碳二亚胺巯基的化学修饰

来源：Cys

修饰反应：烷基化、酰基化、氧化修饰剂：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

5,5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂）：常用的专一修饰巯基试剂胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2-环己二酮苯乙二醛酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂专一性修饰剂：四硝基甲烷（TNM）I2++HI咪唑基的化学修饰

来源：His

修饰反应：酰基化、烷基化

酰基化修饰剂:焦碳酸二乙酯（DPC）

++C2H5OH+CO2

烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH+HI专一性修饰剂吲哚基的化学修饰

来源：Trp

修饰反应：氧化反应修饰剂：

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、2-巯基-5-硝基苄溴（HNBB）、4-硝基苯硫氯二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp/Glu羧基碳二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2-环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、5,5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）Cys二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺、2-巯基-5-硝基苄溴、4-硝基苯硫氯

各种氨基酸侧链的修饰剂

对修饰效果的解释须十分小心：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团不易被修饰。（3）交联修饰（crosslinkingmodification）

分子内交联：利用双功能试剂与酶分子中邻近的侧链基团之间形成共价交联。

分子间交联：借助双功能试剂使酶分子之间发生共价交联。

形成杂化酶例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可在体内将它们输送到同一部位而提高药效。（4）固定化修饰（共价结合法）（covalent

bindingmodification）通过酶表面的极性氨基酸残基，将酶共价连接到水不溶性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。（1）肽链有限水解修饰

（peptidechainlimithydrolysismodification）蛋白类酶（P酶）在酶分子主链的特定部位进行水解，使酶分子的化学结构及其空间结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶切/酶原激活法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。

酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况：1.引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2.仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3.有利于活性中心的形成及与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。

应用实例

1）提高酶活力：

胃蛋白酶原的激活

天冬氨酸酶切除10个氨基酸残基，可使其活力提高4-5倍。胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

2）消除药用酶的抗原性大分子外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去了2/3肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。核苷酸链剪切修饰

（nucleotidechaincleavagemodification）核酸类酶（R酶）在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的催化特性。例：四膜虫L-19IVS（interveningsequencelacking19nucleotides）的形成四膜虫大核rRNA前体自我剪接后所形成的环状IVS可水解成一个比完整IVS少了5’端19个核苷酸的线状IVS（L-19IVS），具有核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、磷酸转移酶、酸性磷酸酯酶和RNA限制性内切酶等5种酶活性肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白的化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。作用：提高酶的催化效率、增强酶的稳定性，改变酶的催化专一性方法：化学修饰法、蛋白质工程（2）氨基酸置换修饰——P酶（aminoacidsubstitutemodification）化学修饰法例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。蛋白质工程：利用定点突变技术。基因序列分析蛋白质结构分析酶活性中心分析引物设计进行基因定点突变酶基因克隆表达变异特性分析新酶结构设计确定突变序列突变基因获得新酶获得核苷酸置换修饰——P酶

（nucleotidesubstitutemodification）将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸置换为另一个核苷酸，从而改变酶的催化性质的修饰方法。方法：定点突变例：L-19IVS活性中心单个碱基置换后，底物专一性改变三、酶分子的物理修饰（physicalmodification）通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。特点：不改变酶的组成单位及共价键方法：高温、高压、变性剂等极端条件原理：副键改变影响酶分子的空间构象第四节修饰酶的化学性质

（以大分子结合修饰为例）一、热稳定性一般提高原因：修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（表1）。二、抗原性修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（表2）。三、对各类失活因子的抵抗力:

化学修饰酶与天然酶相比，对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表3）。四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表4）。五、最适pH

大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在应用上具有重要意义（表5）。六、Km的变化有些酶经化学修饰后，Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。（表6）第五节酶分子修饰的应用一、酶分子修饰的应用

酶学研究方面：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。医药方面：提高药用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。工业方面：提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐受性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。

抗体酶和核酸类酶改造方面有机介质酶催化反应一、酶分子修饰的应用二、酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所必需的，为什么是必