中西医结合导论第三章研究方法

主要内容与要点导航主要内容第一节中西医结合基础研究方法第二节中西医结合临床研究方法要点导航了解现代实验方法理解现代试验方法在中医药研究中运用掌握中西医结合临床研究方法第一页，共41页。第一节中西医结合基础研究方法一、分子生物学研究方法二、细胞生物学与组织形态研究方法三、生物化学研究方法四、医学免疫学研究方法五、功能学研究方法六、中药化学研究方法七、系统生物学研究方法八、动物实验与中医药研究第二页，共41页。第一节中西医结合基础研究方法

一、分子生物学研究方法

生命是由蛋白质、核酸等生物大分子组成的一个复杂体系，具有自我复制、自我更新、自我调控以及对内外环境刺激做出选择性反应的能力，新陈代谢是其基本特征。

分子生物学主要研究细胞成分的物理、化学的性质和变化与生命现象的关系。如遗传信息的传递、基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的功能，以及细胞信号的转导。第三页，共41页。一、分子生物学研究方法

（一）DNA体外扩增1、DNA体外扩增技术：DNA体外扩增主要为聚合酶链反应技术（PCR)，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，可在数小时内对仅有几个拷贝的基因放大百万倍。此法不仅可以用于中药及动物细胞基因的分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于中药鉴定及疾病的诊断等。2、在中医药研究中的应用：PCR技术在中医药实验研究和临床检测中已经得到广泛应用。如检测与恶性肿瘤发生相关的突变基因及中医药的干预调节效应。在中药鉴定上，PCR技术鉴定中药材的道地和品质。第四页，共41页。一、分子生物学研究方法

(二)原位杂交与核酸蛋白印迹1、原位杂交与核酸蛋白印迹技术（1）原位杂交技术

是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。分DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交三类。（2）印迹技术：用于基因组DNA的定性定量分析

①DNA印迹术，检测DNA结构及其差异的技术。②RNA印迹术，检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达技术。③蛋白质印迹术，用于特异蛋白质的存在、半定量等。④斑点及夹缝印迹杂交，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量研究。第五页，共41页。原位杂交技术是利用核酸分子碱基配对互补原理，用预先已标记了用以显示靶基因的已知DNA或RNA片段作为探针，通过探针与组织细胞中靶核酸分子的特异性结合，并借助免疫组织化学技术，在组织细胞原位显示某一特定基因及其转录产物mRNA。印迹技术是指将待检测核酸分子结合到一定固相支撑物上的方法，这些结合在固相支撑物上的核酸分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。第六页，共41页。一、分子生物学研究方法

(二)原位杂交与核酸蛋白印迹

2、在中医药研究中的应用

原位杂交技术涉及中药细胞及机体组织细胞特定核酸在染色体中的精确定位，观察特定基因在细胞中的表达水平、确定组织中有无特异性的细菌与病毒等病原体的感染及中医药在核酸水平的干预效应。技术印迹应用于中药品种的改良，判断某一中药对基因转录的调控作用。第七页，共41页。一、分子生物学研究方法

（三）基因组学与蛋白质组学1、基因组学与蛋白质组学技术（1）基因组学研究内容及技术①结构基因组学：以全基因组测序为目标。

②功能基因组学：以功能鉴定为目标（2）蛋白质组学技术①蛋白质分离技术

②蛋白质鉴定技术第八页，共41页。一、分子生物学研究方法

（三）基因组学与蛋白质组学2、在中医药研究中的应用：比较同病异证和异病同证建立了“证候-基因表达谱”。蛋白质组学技术应用分两类：一是中医药对某一已知蛋白表达调控作用；二是通过用药前后组织或细胞的差异蛋白质组展开来评价中药的疗效。第九页，共41页。一、分子生物学研究方法

（四）生物芯片1、生物芯片技术：分为基因芯片、蛋白质芯片、肽芯片、细胞芯片、组织芯片、物种鉴定芯片、、和基因组分型芯片、药物芯片等。（1）基因芯片技术是同步、高效、快速和低成本，可分为分析芯片、检测芯片和诊断芯片等。（2）蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质给你分析技术。2、在中医药研究中的应用在中医药有效疗法及药物的筛选方面。生物芯片：是缩小了的生物化学分析器。第十页，共41页。二、细胞生物学与组织形态学研究方法

（一）细胞与组织形态学结构研究1、细胞与组织形态学结构染色及观察（1）染色方法：组织细胞；血细胞（2）细胞与组织形态学结构的形态观察显微镜分为：光学显微镜（普通光学、荧光、相差、微分子干涉、暗视野、倒置、激光扫描共焦显微镜）；电子显微镜（投射、扫描电子显微镜）；扫描探针显微镜（扫描隧道、原子力学显微镜）。第十一页，共41页。2、在中医药研究中的应用形态学观察是中西医研究疾病发病机制、转归、疗效评价及中药品质鉴定等最常用的手段。第十二页，共41页。二、细胞生物学与组织形态学研究方法

（二）细胞和亚细胞组分分析细胞和亚细胞组分的分析主要利用细胞化学分析技术。细胞化学分析技术是在保持组织、细胞原有生活结构状态机化学成分的基础上，利用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术手段，对组织与细胞内的化学成分及其变化规律进行定性、定位、定量研究的技术。

在中医药研究中应用于检测人、动物等有机体的不同发育阶段、不同组织部位及其异常生理、病理状态下细胞内结构或功能成分的表达及变化特点。第十三页，共41页。二、细胞生物学与组织形态学研究方法

（三）细胞工程技术

细胞工程是细胞生物学与遗传学的交叉学科，利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照预先设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。

在中医药研究中应用于动物、植物细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色特工程、胚胎工程、转基因生物与生物反应器等及其中医药的调控作用等。

第十四页，共41页。三、生物化学研究方法是运用化学的理论和技术研究生命物质的边缘学科。早期生物整体研究——运用光谱分析、同位素标记、X射线衍射及物理化学技术等对各种组织和细胞成分进行精确分析。第十五页，共41页。三、生物化学研究方法

（一）生物大分子的吸收光谱分析分光光度技术是利用紫外光、可见光、红外光以及激光等测定物质的吸收光谱，并对物质进行定性、定量以及结构分析的技术。使用仪器是分光光度仪。主要用于氨基酸、蛋白质、核酸等物质含量的测定、生物大分子的鉴定、酶活力测定以及酶促反应动力学研究、疾病的诊断及其中医药对细胞或体液中氨基酸、蛋白质、核酸等大分子含量的影响。第十六页，共41页。三、生物化学研究方法

（二）生物大分子的电泳与层析分离：对组织细胞与体液中氨基酸、蛋白质核酸等进行分离

纸上电泳、醋酸纤维素凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳1、电泳技术：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳等凝胶层析技术、2、层析技术：离子交换层析技术高效液相层析技术亲和层析技术第十七页，共41页。三、生物化学研究方法

（二）生物大分子的电泳与层析技术三、生物化学研究方法

（二）生物大分子的电泳与层析分离电泳与层析分离技术是对组织细胞与体液中的氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等分离的主要研究方法，用于分析物质纯度和分子量的测定等。在中医药研究中，电泳技术用于中药材鉴别及中医药对氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等生物大分子调控效应的研究。第十八页，共41页。三、生物化学研究方法

（三）透析技术研究方法是利用半透膜的选择性在溶液里分离大分子和小分子的一种分离技术。常用于除去大分子（如蛋白质、核酸）中的小分子杂质。中医药研究中，其主要可应用于中药药理学及针刺机制研究等方面。利用微透析技术可以连续观察目的部位局部的药效学变化，对药效进行评价。第十九页，共41页。四、医学免疫学研究方法

（一）抗原抗体的检测凝集反应：检测标本中不溶性颗粒抗原方法沉淀反应：检测标本中可溶性颗粒抗原

免疫标记反应免疫荧光法酶联免疫分析法放射免疫分析法免疫印迹法化学发光免疫分析免疫PCR

用荧光素、同位素或酶标记，优于抗原抗体检测第二十页，共41页。抗原抗体的检测的应用因为抗原抗体的检测即可评价免疫系统功能，也是评价其他各系统相关功能的状态及其变化的情况，因此，该技术已广泛应用于中医药基础理论、作用机理、疗效评价等。在抗原抗体反应中，可用已知抗体（抗原）检测未知抗原抗体，并可根据需要选择定性或定量的测定方法。第二十一页，共41页。四、医学免疫学研究方法

（二）免疫分子的研究免疫分子包括：免疫球蛋白、补体、细胞因子、MHC分子、CD分子、黏附分子、模式识别受体(Toll样受体)等。由于免疫分子是免疫细胞免疫反应、免疫信息的主要执行者，而免疫调节是中医药防治疾病的重要机制之一，因而，对免疫分子的检测是中医药研究中的中医指标。免疫球蛋白存在于血液、组织液和外分泌液中，可与抗原的特异性结合，发挥中和毒素、阻断病原入侵、清楚病原微生物或导致免疫病理损伤；同时可协助补体、自然杀伤细胞、巨噬细胞等清楚免疫复合物、杀伤肿瘤细胞等，是机体发挥体液免疫功能的主要成分之一。第二十二页，共41页。四、医学免疫学研究方法

（三）免疫细胞的研究参与免疫应答或免疫应答相关的细胞统称为免疫细胞。是免疫应答的主要执行者。包括：淋巴细胞、树突状细胞、单核-吞噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。通过中医药、针灸对机体免疫功能的干预效应及其机制均已成为中医药药理学、毒理学及其临床效应评价的核心内容。第二十三页，共41页。五、功能学研究方法（一）循环系统功能学研究方法1、循环系统功能学检测（1)心肌电生理：①心肌细胞电生理检测动物心电图描计（2）心脏泵学功能：超声心电图，评价指标：（3）血流动力学研究（4）微循环系统功能学：医学显微图像分析系统2、应用上述方法功能学指标是正常、疾病状态（疾病模型）及中医药干预循环系统功能评价不可或缺的指标。第二十四页，共41页。五、功能学研究方法（二）血液系统功能学研究方法主要包括血液的流动性和凝固性，血液有形成分等检测。在止血药研究和血瘀、血虚模型相关基础及药效学研究中，观察这些指标均已成为干预后血液系统功能评价必不可少的指标。第二十五页，共41页。五、功能学研究方法（三）呼吸系统功能研究方法评价指标：1、肺通气功能评价：评价正常、疾病（特别是慢阻肺）模型及相关干预后肺功能好坏必不可少的指标2、血气分析：也用于慢阻肺疾病不同证候模型、哮喘、肺纤维化等疾病的研究中。对与肺功能和电解质等指标联合测定。

第二十六页，共41页。五、功能学研究方法（四）泌尿系统功能研究方法检测肾功能：（五）消化系统功能研究方法检测胃肠动力学和消化道平滑肌生理第二十七页，共41页。五、功能学研究方法（六）神经与运动系统功能学检测1、检测内容：（1）痛觉研究（热、电、机械、化学刺激法）（2）镇静催眠作用研究（3）抗癫痫研究（4）学习记忆功能（5）脑电生理研究：脑电图、脑立体定位术、大脑皮质诱发电位（6）骨骼肌功能：生物电和机械收缩特性（7）神经反射：反射弧的结构和功能完整性补益开窍类中药针灸骨伤疗法第二十八页，共41页。六、中药化学研究方法（一）中药化学成分的分离纯化：多种联用色谱法（二）中药化学成分的结构确证（三）计算机辅助中药新药设计（四）中药化合物的活性评价：分子、细胞和动物水平（五）方剂药物代谢动力学分析：血药和非血药浓度（六）中药定量构效关系研究：结构参数与生物活性数据（七）中药化学成分的生物转化研究（八）中药复方药效物质基础研究第二十九页，共41页。七、系统生物学研究方法系统生物学是研究生物系统中所有成分（基因、mRNA、蛋白质）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的科学。主要内容：系统结构及相互作用、系统的动态特征、系统控制及规律和系统设计。（一）转录组学研究研究生物细胞中转录组发生和变化规律。（二）代谢组学研究研究生物体系受外部刺激后所产生的所有代谢产物种类、数量和变化的规律。（三）生物信息学由生物学、计算科学以及应用数学等学科交叉形成。第三十页，共41页。八、动物实验与中医药研究（一）实验动物的选用与人类功能、代谢及疾病特点相近似的动物；选用解剖生理特点符合实验目的的动物；选用遗传背景明确、具有已知菌丛或无菌动物；选用具有某种特殊反应的动物各系统实验动物的选择：第三十一页，共41页。八、动物实验与中医药研究（二）中医药研