园艺植物生物技术第七章

geneEnhancerelementcontrollingsequencesStructuralgeneWhatisgene?Genecanbedefinedasasegmentofgenomewithaspecificsequenceofnucleotides,whichhasaspecificbiologicalfunction.UpstreamelementTATAboxExonExonExonintronintronintron现在是1页\一共有97页\编辑于星期二

GeneticEngineering

alsocalledgenetic

modification,isthedirectmanipulationofanorganism'sgenomeusingbiotechnology.

NewDNA

maybeinsertedinthehostgenomebyfirstisolatingandcopyingthegeneticmaterialofinterestusingmolecularcloningmethodstogenerateaDNAsequence,orbysynthesizingtheDNA,andtheninsertingthisconstructintothehostorganism.

Genesmayberemoved,or"knockedout",usinganuclease.Genetargetingisadifferenttechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene,andcanbeusedtodeleteagene,removeexons,addagene,orintroducepointmutations.现在是2页\一共有97页\编辑于星期二Anorganismthatisgeneratedthroughgeneticengineeringisconsideredtobeageneticallymodifiedorganism(GMO).ThefirstGMOswerebacteriain1973.Geneticallymodifiedcrops(GMCs,GMcrops).Thefirstgeneticallymodifiedplantwasproducedin1982,usinganantibiotic-resistanttobaccoplant.ThefirstgeneticallymodifiedcropapprovedforsaleintheU.S.,in1994,wastheFlavrSavrtomato,whichhadalongershelflife.现在是3页\一共有97页\编辑于星期二7.1InstrumentalEnzymeof

GeneEngineeringRestrictionendonucleases(限制性内切酶)Ligase（连接酶）Polymerase（聚合酶）Nuclease（核酸酶）Terminalenzyme（末端转移酶）Methylase（甲基化酶）现在是4页\一共有97页\编辑于星期二7.1.1RestrictionEndonuclease一类能识别双链DNA分子中某一特定核苷酸序列，并能对核酸内部的磷酸二酯键进行切割的一种内切核酸酶。TypeⅠendonuclease：识别专一位点，切割不专一；TypeⅡendonuclease：识别专一位点，切割专一；TypeⅢendonuclease：识别专一位点，切割不专一。现在是5页\一共有97页\编辑于星期二TypeⅡendonucleaseRecognize：4~6个核苷酸，回文序列Cutingresult：astickyends(粘性末端)：Pst1EcoR15’-CTGCA

G-3’5’-G

AATTC-3’3’-G

ACGTC-5’3’-CTTAA

G-5’

abluntends(平末端)：NruⅠ5’TCG

CGA3’5’AGC

GCT3’现在是6页\一共有97页\编辑于星期二Isoschizomers(同裂酶)：指来源不同，但识别相同靶序列的核酸内切酶。如：HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)Isocaudarner(同尾酶)：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。BamHⅠ

BclⅠG

GATCC

TGATC

ACCTAGG

ACTAGT现在是7页\一共有97页\编辑于星期二7.1.2DNAligase

（DNA连接酶）T4DNA

ligase：joinbluntendsorstickyendsEscherichiacoliDNA

ligase：joinstickyends现在是8页\一共有97页\编辑于星期二7.1.3DNApolymeraseDNA

polymeraseⅠofE.coli：

5’→3’聚合活性，5’→3’外切活性,3’→5’外切活性2.KlenowfragmentofDNApolymeraseⅠofE.coli

5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性3.DNA

polymeraseofPhageT4

5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性，活性高200倍。4.Reversetranscriptase(反转录酶)5.DNA

polymeraseofT7phage：活性高1000倍现在是9页\一共有97页\编辑于星期二

OtherDNA-modifyingenzymesTerminaltransferase(末端转移酶)：能以具3’-OH的单链和双链的DNA为引物，在有底物dNTP和Mg2+和Co2+下，把脱氧核苷酸一个接一个加到DNA的3’端上。

Alkalinephosphatase(碱性磷酸酶)：在碱性条件下（pH8~9），可除去DNA、RNA

5’端磷酸基团，使5’端变为-OH。防止DNA的自身连接，方便5’端的放射性标记。

Methylase(甲基化酶)：通过对DNA分子上的特定序列位点进行甲基化修饰，使该序列免受能识别和切割该序列的限制性内切核酸酶的切割。

Nuclease

S1(S1核酸酶)：能降解单链DNA或RNA，产生带5’磷酸的单核甘酸或寡核甘酸。现在是10页\一共有97页\编辑于星期二7.2Vectors（载体）Vector：能把外源DNA带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁殖、传代或进行表达。Avecctorshouldhavethefollowingfeatures：Containareplicon,能自主复制Markergenes,可供选择的遗传标记Uniquecleavagesite,克隆位点ContainsuitablecontrolelementsforexpressionofclonedDNA,suchaspromoters,terminators,控制元件现在是11页\一共有97页\编辑于星期二7.2.1Plasmids(质粒)Plasmidsaredouble-stranded,colsedcircularDNAmolecules,whichexitstinthecellasextrachromosomalunits.存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小1~500bp。可自身复制和表达，常有1~3个抗药性基因，便于筛选。经过适当改选后便可成为良好的载体。克隆外源DNA片段＜10kb现在是12页\一共有97页\编辑于星期二（4363bp）oripBR322wasoneofthefirstcloningvectorstobeconstructedandthemostwidelyused.

Itisa4.36kbdoublestrandedcloningvecctor.ItcontainsColE1oriofreplicationandtwoantibiotic-resistancegenesand20uniquerecognitionsites.TheinsertedDNAfragmentwaslessthan10kb.现在是13页\一共有97页\编辑于星期二pUCVectors1、2.7kbandpossessColE1oriofreplication；

2、amprR（氨苄青霉素抗性）gene,不含核酸内切限制酶的识别位点。

3、operon(启动子)oflacZ（大肠杆菌β-半乳糖基因）andcodingα-肽链的DNA序列；

4、MCS(多克隆位点)locatedinlacZ’

gene。MCS不破坏该基因的功能。在含氨苄青霉素、x-gal和IPTG培养基上，未转化的细菌不能生长，蓝色菌落为野生型pUC，白色菌落为重组pUC。现在是14页\一共有97页\编辑于星期二现在是15页\一共有97页\编辑于星期二7.2.2λ

phage(噬菌体)vectorphage15kb＜insertedDNAfragment＜23kbVirusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)Lyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)现在是16页\一共有97页\编辑于星期二VectorcarryLacZ'gene：在诱导物IPTG和X-gal存在时，β-半乳糖苷酶与相应的Lac-宿主铺平板可形成深蓝色噬菌斑。当插入外源基因时，所产生的重组噬菌体丧失α互补能力，形成无色噬菌斑。Theimmunefunction(免疫功能失活载体)：载体基因组中有一段免疫区（酶切位点），外源基因插入失活，无法进入溶原周期，形成清晰噬菌斑。现在是17页\一共有97页\编辑于星期二7.2.3Cosmid(柯斯质粒)vectorsThevectorshavingbothcos（cohesive）ofλphageandoriofreplicationofplasmid。Cosmidvectors可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞,但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。现在是18页\一共有97页\编辑于星期二COSmidpHC79is4.3kb

DNAfragmentandmadeofpBR322andcossiteofλphage.InsectionDNAfragmentmorethan40kb。现在是19页\一共有97页\编辑于星期二7.2.4Artificialchromosomevectorsbacterialartificialchromosome,（BAC,细菌人工染色体）yeastartificialchromosome,（YAC,酵母人工染色体载体）现在是20页\一共有97页\编辑于星期二Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.现在是21页\一共有97页\编辑于星期二现在是22页\一共有97页\编辑于星期二7.3Gene

cloning

现在是23页\一共有97页\编辑于星期二Genelibraryscreening（文库筛选法）Map-basedcloning(图位克隆技术)Transposontag（转座子标签法）Differentialdisplayanalysis（基因差异表达分析）Homologysequences（同源序列法）Genechip（基因芯片技术）Strategy现在是24页\一共有97页\编辑于星期二7.3.1GenelibraryscreeningGenelibrary：是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。Type：genomiclibrary（基因组文库）cDNAlibrary(cDNA文库)现在是25页\一共有97页\编辑于星期二(1)GenomicCloning①Vectorpreparation：Thenumberofrecombinantsforacompletegenomiclibrarycanbeestimated：

N=ln(1-P)/ln(1–f)(P=任一基因被克隆的概率)(f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小)

Example:genomicsoftonatowas9.5×108bp，基因文库中克隆片段的平均大小为20kb，则构建一个完备性为0.99的基因文库至少需要N=2.2×105

cloning。现在是26页\一共有97页\编辑于星期二②PreparationoflongDNAfragment

尽可能避免机械切割

部分消化：低熔点琼脂糖包埋，再酶切。一般可得到＞600kb的DNA.③JunctionofgenomicDNAwithvectors（比例1:15）④Genetictransformation（电转化）⑤Cloneselectionandverification

（随机，脉冲电泳）⑥Libraryamplification,packagingandpreservation现在是27页\一共有97页\编辑于星期二(2)cDNAlibraryPreparatonofmRNA：oligo(dT)SynthesisoffirststrandofcDNA:reversetranscriptasesSynthesisofsecondstrandofcDNA:RNA-cDNA杂合分子AAAA(A)nTTTT(T)nRNA酶H,大肠杆菌DNA聚合酶IAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nRNA片段为引物合成第二链T4DNA聚合酶置换合成现在是28页\一共有97页\编辑于星期二CloningofcDNA：Mondify：cDNA甲基化处理，保护内部酶切位点，添加接头。cloning：将cDNA克隆到载体中。关键是cDNA与载体的比例。现在是29页\一共有97页\编辑于星期二PCR介导法现在是30页\一共有97页\编辑于星期二Introductiontohostcells现在是31页\一共有97页\编辑于星期二(3)

ScreentheinterestinggeneAccordingtonucleotidesequenceofgene相关基因→DNA探针→杂交Accordingtoexpressionofgene氨基酸序列→合成cDNA探针→杂交ScreenbyPCR

现在是32页\一共有97页\编辑于星期二7.3.2Map-basedcloningMap-basedcloning(图位克隆法)：identificationofDNAmarkerlinkedtotargetgeneonthegeneticmap，thenapproachtoandisolationthegenesbychromosomejumpingorchromosomelanding.Produre：目的基因的初步定位精细定位构建目的基因的精细物理图谱并鉴定出含目的基因的小DNA片段筛选文库以找出目的基因并通过遗传转化实验证实其表型功能。

现在是33页\一共有97页\编辑于星期二现在是34页\一共有97页\编辑于星期二现在是35页\一共有97页\编辑于星期二7.3.3Transposontagging(转座子标签)andT-DNAtaggingTransposonistheDNAsequencecanmoveonachromosome.能从一个基因座位转移到另一个基因座位，当转座子插入到某个基因内部或邻近位点时，会使插入位置的基因失活并诱导突变型；当转座子切离时，又使目的基因恢复活性。现在是36页\一共有97页\编辑于星期二Transposontagging：localizationandcloningagene

usingtransposoninsertion

causingonegeneinactivation.Procedure：转座子导入目标植物筛选获得纯合突变株构建突变体核基因组文库转座子片段作探针进行杂交获得转座子侧翼序列野生型植物核DNA获得完整目的基因构建野生型核基因组文库现在是37页\一共有97页\编辑于星期二T-DNAtaggingPrinciple

Likethetransposontaggingmethod，ButusingT-DNAofTiplasmidinagrobacterium(农杆菌)causemutant，andfindorseparatagene。现在是38页\一共有97页\编辑于星期二7.3.4Analysisofgenedifferentialexpression

基因差异表达分析Variousprocessesoflifeareaccompaniedbyselectiveopeningandclosing

of

differentgenes.Accondingtothese，severalgenecloningmethodweredeveloped.mRNA差异显示技术抑制性差减杂交代表性差异分析

基因表达序列分析cDNA-AFLP技术现在是39页\一共有97页\编辑于星期二根据真核生物成熟mRNA的多聚A尾巴设计一个锚定引物和一个随机引物对RNA进行反转录和PCR扩增，然后进行电泳分析，分理出有差异的条带，制成探针筛选cDNA文库或基因组文库，找出差异表达的基因。(1)DDRT-PCR(mRNA差异显示)：现在是40页\一共有97页\编辑于星期二(2)SSH（suppressionsubtractivehybridazation抑制性差减杂交）

现在是41页\一共有97页\编辑于星期二7.3.5Homology-basedcloning

同源序列法Genessequencesarehomologybetweenplantsbelongtothesamespeciesorgenus.Soagenecanbeisolatedaccordingtothesequenceofisolatedgeneofanothercloserelativeplant.PCRmethod.从待分离植物的DNA中直接扩增DNA片段，并与已知序列比较，确认；Hybridizationwithgenelibrary.以已知序列的基因作探针，从待分离材料的核DNA文库或cDNA文库中钓取同源性较高的克隆，测序并比较、确定。

现在是42页\一共有97页\编辑于星期二现在是43页\一共有97页\编辑于星期二7.3.6Genechip(基因芯片)Principle：Throughthecomparisonbetweendifferentspecies,orbetweendifferentindividualsofthesamespecies,orthesameindividualindifferentgrowthperiodorgeneexpressionbetweenthedifferentenvironmentalconditions。Method:采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNAprobe固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。现在是44页\一共有97页\编辑于星期二

现在是45页\一共有97页\编辑于星期二1）DNAmicroarrayconstructionandprinting.在序列分析的基础上，根据基因序列中特异的片段设计出一系列10-50bp长、代表该生物所有基因或欲分离目的基因信息的DNA片段，固定在芯片上。2）Preparationoftargetsample.不同发育时期或不同处理条件下植物体特定器官的mRNA用荧光标记。3）Hybridizationanddetection.通过杂交位点及信号强弱，可以得知在不同条件下各基因是否表达及表达强弱，进而找出与该生理功能相关的目的基因。4）Datacollectionandanalysis(基因芯片数据的收集和分析)Produreofgenechip现在是46页\一共有97页\编辑于星期二7.4

Gene

transferinplant

基因的遗传转化现在是47页\一共有97页\编辑于星期二Plantgenetictransformation：应用分子重组技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中，并使其在后代植株中得以表达的过程。现在是48页\一共有97页\编辑于星期二7.4.1、Receptorsystem(受体系统)Concept：是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。Theestablishmentofreceptorsystemispremise.现在是49页\一共有97页\编辑于星期二(1)RequirementsforreceptorsystemingenetictransformationHighlyefficientandstableregeneration(高效稳定的再生能力)Geneticstability(较高遗传稳定性)Stablesourceofexplants(稳定的外植体来源)：无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等Sensitivetoselectiveantibiotics(对选择性抗生素敏感)EasyinfectedbyAgrobacterium(对农杆菌侵染的敏感性)现在是50页\一共有97页\编辑于星期二(2)Typesofreceptorsystem（1）Tissuereceptorsystem(组织受体系统)愈伤组织再生系统：转化率高，来源容易、易扩繁、适用广，稳定性差，嵌合体多；直接分化再生系统：操作简单，无性系变异小，转化率低，嵌合体多。（2）Protoplastreceptorsystem(原生质体受体系统)高效摄取外源基因、转化准确，无嵌合性，适用广;培养周期长，难度大，再生频率低。（3）Germcellreceptorsystem(生殖细胞受体系统)接受外源DNA潜能强，纯合体便于选育，操作简便，但受季节限制。现在是51页\一共有97页\编辑于星期二7.4.2Transformationmethod

转化方法Directtransformethod(直接转化法)Vectormediatedgenetransfor(载体介导的转化)Germplasmsystemtransfor(种质系统转化)现在是52页\一共有97页\编辑于星期二①Chemicalinduction(化学诱导）Receptor：protoplast(原生质体)Pricinple:PEG（聚乙二醇）可使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触与粘连，改变细胞膜表面电荷，增加细胞膜通透性。在二价阳离子共同作用下，使外源DNA沉积在细胞膜表面，促使细胞主动吸收外源DNA，实现外源DNA导入受体细胞。（1）DirecttransformationofexogenousDNA现在是53页\一共有97页\编辑于星期二procedure：Advantage&disandvatage

Simpleoperation,lowcost,noneedexpensiveinstrument,awideplantrange,goodrepeatability,lowconversionrate：10-5~10-3外源目的基因的制备原生质体制备目的基因与原生质体的转化培养转化体的鉴定和再生植株的培养现在是54页\一共有97页\编辑于星期二Principle：高压电脉冲使植物细胞膜或原生质体上造成非对称穿孔，每个细胞膜上形成上百个瞬间通道，允许外源基因的进入。procedure：制备含目的基因的质粒DNA→制备植物原生质体悬浮液或一定处理的植物组织→混合在200~600V/cm的电场处理若干秒→原生质体培养和转化子筛选→再生植株鉴定与培养。②Electroporation

电穿孔法Advantage&disandvatage：Easyoperation,highconversionrate,butneedtoprotoplastculture.现在是55页\一共有97页\编辑于星期二③Genegun(基因枪)Principle：利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱动力，将包裹有生物活性DNA的金属小颗粒加速，高速轰击植物组织或细胞，使外源基因实现穿壁并导入受体细胞中，然后通过细胞核组织培养技术，再生出新的植株类型。gunpowder现在是56页\一共有97页\编辑于星期二Highpressure

gasgenegunAdvantage&disandvatage：unlimitedofhost,controllable,widetargetreceptors,goodrepeatability.transformatiinrateisextremelylow,costishigh,thechimericratioislarge,geneticstabilityispoor.

现在是57页\一共有97页\编辑于星期二④Microinjection（显微注射法）Principle：直接将外源基因注入已固定的植物细胞或组织中，从而实现基因转移。注射部位包括子房、穗基、分蘖节等。Receptorcellsfixed：琼脂糖包埋法，多聚L-亮氨酸粘连法，吸管支持法。Advantage&disandvatage：Controllable,hightansfornationrate,noharmtoreceptorcells,butcomplicated,time-consumingandlowworkingefficiency,morecopy,pronetomutation.现在是58页\一共有97页\编辑于星期二（2）Vectormediatedgenetransfer

载体介导的转化Agrobacteriumtumefaciensmediatedgenetransfer（根癌农杆菌介导的转化）Agrobactriumrhizogenes(发根农杆菌介导的转化)现在是59页\一共有97页\编辑于星期二Tumorinducingplasmid(Ti质粒)isalargeplasmidwhichharboredinA.tumefaciensandcausecrowngallinplant.当根癌农杆菌感染植物时，菌体不进入植物细胞，而仅是Ti质粒中称之为“T-DNA”的DNA片断进入寄主细胞并插入基因组中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进行转录和翻译。①Tiplasmid(根癌农杆菌Ti质粒)现在是60页\一共有97页\编辑于星期二organizationofTiplasmid（180～240kb）：T-DNAregion（与基因转移相关），Virregion（激活T-DNA转移），Conregion（调控Ti质粒在农杆菌间发生结合转移)andOriregion（调控农杆菌自我复制)。T-DNAregionLeftborderRightborderauxincyt冠瘿碱合成酶基因oriConvirVir现在是61页\一共有97页\编辑于星期二Remould

Tiplasmid(Ti质粒改造)Disarm:删除T-DNA左右边界中的onc（激素合成）基因，构建卸甲载体。Addselectivemarker:引入大肠杆菌质粒的复制起点和选择标记。Addenzymesite:插入人工多克隆位点。IntroducePlantgenepromoterandpoly(A):引入植物基因的启动子和信号序列Deletenon-essentialsequences:除去其他非必需序列♧Tivectors:pGV3850,pGV2250,pTiB6S3-SE载体。现在是62页\一共有97页\编辑于星期二Function：中间载体与卸甲载体共同组成一个植物基因转化载体系统，完成基因的转化。Organization：

“植物特异性启动子+目的基因+终止子”，“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”。

Expressionvector(Ti中间表达载体)现在是63页\一共有97页\编辑于星期二Cointegratevectors

(Ti共整合转化载体)ThedisarmedTivectoriscovalentlylinkedtodonorvectorwithgeneofinterest-T-DNAbordersequencespresentinaA.tumefaciensstraintoactasoneunit.E.coli中间载体+卸甲Ti质粒以同源重组方式整合成共合体，分子量较大，共合体的形成频率较低，需用Southern杂交或PCR进行检测，构建较困难。现在是64页\一共有97页\编辑于星期二

CointegratedvectorbasedonPBR322homologousThevectorhaspBR322DNAintheT-DNAregion,whichprovidearegionofhomologywithmostothercloningvectors.RecombinatoninthetwoplasmidsDNAproducesthecointegrate.(在卸甲载体的T-DNA区引入PBR322，中间载体是PBR322质粒或其衍生质粒，两者通过同源重组实现目的基因及选择性标记基因与卸甲Ti质粒的整合，以顺式方式将基因转化到植物细胞中去。)基于左边界内部同源区（LIH）的转化系统，即SEV系统。受体Ti质粒pTiB6BS3（TL），中间载体是pMON200（TR）.含有抗性嵌合基因便于转化植株的直接筛选。现在是65页\一共有97页\编辑于星期二共整合载体co-integratedvector现在是66页\一共有97页\编辑于星期二Binaryvectors

Ti双元转化载体的构建Concept:指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统。Principle：位于一个Ti质粒上的Vir基因可以反式激活位于另一个Ti质粒上的T-DNA转移。使插入到T-DNA区的外源基因导入植物细胞中。含有广泛寄主范围的复制起点，代替了重组同源区。现在是67页\一共有97页\编辑于星期二Binaryvector(双元载体系统)现在是68页\一共有97页\编辑于星期二Transfermechanism(转化机制)

根癌农杆菌在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，根癌农杆菌细胞中的Ti质粒上通过特异性识别信号分子诱导其Vir区基因的表达，产生VirD1和VirD2蛋白，该2种蛋白可切割T-DNA的左右边界，产生一条单链T-DNA分子，进入植物细胞，并整合到植物基因组中。

Techniques：

Leaf-discmethod(叶盘法）co-culturewithprotoplast（原生质体共培养）plantinfection(整株感染)Procedure：

含重组Ti质粒的工程菌培养及转化；选择合适的外植体；工程菌与外植体共培养；外植体脱菌及筛选；转化植株再生及鉴定。现在是69页\一共有97页\编辑于星期二Interestedgenestransferinto(dicotyledonous)plant

cellsAgrobacterium

mediatedtransformation现在是70页\一共有97页\编辑于星期二Advantage：Naturalvectorsystemwithhightransferrate,exogenousgenestransferedareoftensinglecopy,rarelymethylationandgeneticallymodifiedsilence,excellentstabilityofgene,lowcost,simpleandeasytooperate.DisadvantageHostrangelimated(双子叶植物和少数单子叶植物)，Needantibioticforalongtime(因外植体再生阶段脱菌比较困难)。现在是71页\一共有97页\编辑于星期二②A.rhizogenesmediavectors

发根农杆菌介导的载体WhenAgrobacteriumrhizogenes(发根农杆菌)infectplants，itcaninduceplanttoproducemanyadventitiousroots.Therootsgrowquicklyandconstantlybranchingintohairyroot,whichisinducedbyRiplasmidinfact。现在是72页\一共有97页\编辑于星期二Noneedtodisarm.Asinglecellclonecanderivedfromhairyroot,andchimeras(嵌合体)isavoid.Ri质粒可直接作为中间载体；可与Ti质粒配合使用建立双元载体系统；Hairrootisappropriateforinvitrocultureandforproductionofsecondarymetabolites(次生代谢产物)。AdvartageofRiplasmid现在是73页\一共有97页\编辑于星期二Ricointegrationvectors(Ri共整合转化载体的构建)中间载体常用pBR322,pBI121等。把目的基因插入到T-DNA中，构成中间表达载体。然后通过诱导菌株的协助质粒和野生型的发根农杆菌直接进行三亲杂交，通过同源重组把中间载体整合到Ri质粒的T-DNA中。Ribinaryvectors(Ri双元转化载体的构建)基本程序与Ti质粒相同。现在是74页\一共有97页\编辑于星期二A.rhizogenesmediatedtransformationTheprincipleandprocedureofitstransferassameasA.tumefaciensBinaryvectorsystem现在是75页\一共有97页\编辑于星期二(3）Germplasmtransfersystem

(种质系统转化法)①Insituvacuuminfiltrationmethod（原位真空渗入法）Procedure：将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌介导下发生遗传转化。Advantagesanddisadvantages：Convenient,quick,reliable,lowcost,hightransferrate.Itsapplicationneedsdevelopment.现在是76页\一共有97页\编辑于星期二②DNAtransferviapollen

(花粉管通道法)Principle：植物在双受精完成以后，受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。该时期的细胞不具备完整的细胞壁和核膜系统，细胞内外的物质频繁交流。通过花粉管通道渗透进入胚囊的外源DNA片段有可能进入受精卵细胞，并进一步被整合进受体植物基因组中。现在是77页\一共有97页\编辑于星期二③Seedsoakingmethod

(种子浸泡法)Principle：Usingplantcellsmaterialtransportationsystem,exogenousDNAisdirectlytransforedintoreceptorcells.通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统将外源DNA运至每个细胞。通过内吞作用将外源DNA摄入细胞。现在是78页\一共有97页\编辑于星期二7.5IdentificationofgenetransformationplantReporterorselectablegenes(利用选择标记基因和报告基因)RecombinantDNA(利用重组DNA分子鉴定)Transcriptionorexpressionofexogenousgene(利用外源基因的转录或表达鉴定)现在是79页\一共有97页\编辑于星期二7.5.1Selectablegenes

选择标记基因Antibioticresistancemarker：nptⅡ(新霉素磷酸转移酶基因)，hpt(潮霉素磷酸转移酶基因)，Herbicideresistancemarker：Bargene(草丁膦乙酰转移酶）Antimetabolitemarker（抗代谢物标记基因）：dhfr(二氢叶酸还原酶基因)现在是80页\一共有97页\编辑于星期二7.5.2Reportergene

报告基因Opinesynthase(冠瘿碱合成酶基因)：检测冠瘿碱Chloramphenicolacetyltransferase(氯霉素乙酰转移酶基因,cat)：放射性检测β-galactosidase(半乳糖苷酶基因,GUS):蓝色Greenfluorescentprotein(,绿色荧光蛋白,GFP)：绿色荧光Anthocyanins(花青素合成相关基因)(C1,B/R):红色斑点现在是81页\一共有97页\编辑于星期二

RecombinantDNAcharacteristic

利用重组DNA分子特征的鉴定Enzymedigestionprofile(DNA分子酶切图谱鉴定)PCR鉴定Southern杂交现在是82页\一共有97页\编辑于星期二

Transcriptionorexpressionofexogenousgene

利用外源基因的转录或表达鉴定NorthernblottingWesternblottingProteinimmunoassay(蛋白免疫测定)现在是83页\一共有97页\编辑于星期二现在是84页\一共有97页\编辑于星期二7.6Strategytoimprovetheexogenousgeneexpression提高外源基因的表达水平现在是85页\一共有97页\编辑于星期二7.6.1Transgenesilencing

转基因沉默现象Transgenesilencing（转基因沉默）:导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代出现表达收到抑制，甚至完全不表达的现象。转基因在受体植物中往往不能稳定表达，有