cn.4a一种菌肽活性蛋白饲料及其制备和应用方法

(19)中民国家知识

(21)(22)(71)地址410003湖南沙市开福区洪山98(72)发明人(74)专利机构长沙市融智专人A23K1/18权利要求书2说明书14序列表24A23K1/16(2006.01)C12P21/02(2006.01)权利要求书2说明书14序列表24PichiaPastoris这一理想的真白高水平表达系统，将青鱼鱼生长激素定向克隆到酵母整合型质AA

(10)申请公布号 (43)C12R1/84A权利要求1/2 所述的鱼类生长激素工程酵母菌是将青鱼生长激素cDNA定向插入含强启动子根据GeneBank数据库中登记的青鱼GH序列AF389238设计引物，P15’-ATGGCTAGAGCATTAGTGCT-3’；5’-提取青鱼脑垂RNART-PCRcDNAcDNA1μg/μLRNA模板5μL0.5μg/μLoligo(dT)18引物1μLDEPC处理的ddH2O补足12μL65℃水5min300rpm离心30S冰上1min再依次加入5×ReactionBuffer4μL40U/1μL300rpm4260min70℃终止反应5min1μL10×PC.5μ10m/μL1μL10mmol1μL5u/μL1μL，ddH2O补足20μLPCR反应流程94预变3min941min55℃退火1min721min3010min4根据步骤2)得到的青鱼生长激素cDNA序列和表达载体pPIC3.5K的多克隆位点，EcoRINotI的酶切位点的特异引物，pPIC3.5K-GHF5-GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3pPIC3.5K-GHR5’-TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’；12.5μL10mM/μLPCR94预变性3min94℃变性1min55℃退火1min72℃延伸1min30循环，7210min410min将重组质粒pPIC3.5K-bcGH电击转化导入组氨酸缺陷型酵母GS115菌株获得工A权利要求2/2 /min/min一种菌肽活性蛋白饲料及其和应用方 hormoneGH)al.1979[1]广泛的重视。人类已利用工程技术合成了哺乳类和鱼类的重组GH(rGH)，并证明GH能被鱼类消化道完整吸收而进入血液并保持促进鱼类生长的活性(HertzY1991)[2]，文90％4 [0005]本发明的目的是将重组青鱼生长激素定向地整合到酵母中并使之高效 [0010]所述的鱼类生长激素工程酵母菌是将青鱼生长激素cDNA定向插入含强启动子AOXI的表达载体pPIC3.5k构建表达pPIC3.5K-bcGH再将其电击转化导入组氨酸缺陷型酵母GS115菌株得到将获得的鱼类生长激素工程酵母菌经过如下活化培养过程后得到发酵用的液取-80℃冰箱保藏的重组bcGH酵母菌种划线转接到MD平板，30℃恒温倒置培养3-5天接1环生长良好的MD平板至装有50mL培养基的500mL摇瓶中置于300rpm摇床，30℃振荡培养菌液OD6002-6间为10-24时即可。96hpH6.53017％。[0012]步骤(2)所述的喷雾干燥的条件如下：进风温度110-1301.00-1.20m3/min进样速度12.00ml/minmin10.00-14.00ml/min。所述的鱼类生长激素工程酵母菌的构建方法具体包括以下步骤P15ATGGCTAGAGCATTAGTGCT-5’-[0018]2)Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书提取青鱼脑垂体总RNA，根据invitrogen公司逆转录试剂盒说明书合成青鱼cDNA第一链：RNA模板5μL(1μg/μL1μLoligo(dT)180.5μg/μLDEPC处理ddH2O12μL65水浴5min300rpm30S立即放在1min再依次5×ReactionBuffer4μL40U/μLRNase1μL10mM/μLdNTPMix2μL1μL(1U/μL300rpm30S42℃60min705min。 μL10×PCR2.5μL25mmol1.5μL10mM/μLP1P21μL10mM/1μL5U/μ1μLddH2PC3min94℃1min55min2℃1min3[0020]3)2)cDNApPIC3.5K5GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATAGTG- [0024]2)cDNApPIC3.5K-GHF，pPIC3.5K-GHRPCR增。PCR体系东盛生物科技公司提供的2X1mL规格的2×PCRTaqMix12.5μL10mM/μL1μL1μg/μL)cDNA93min941min551min7210min4[0027]5)将重组质粒pPIC3.5K-bcGH电击转化导入组氨酸缺陷型酵母GS115菌株(购自 DNART 图2为pPIC3.5K-bcGH的EcoRI/NotI酶切电泳图； pPIC3.5K-D 图3为重组酵母菌落PCR图； DN Marker2-4.55.56.06.5， 4.55.56.0，6.57.0Marker r r27 67 r7 r r07 P15P25 参照invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书，提取青鱼脑垂体总RNA。根据invitrogencDNARNA5μL(1μg/μL)、12μL65300rpm30S，立即放在冰上1min，再依次加入5×ReactionBuffer4μL40U/μL1μL(1U/μL300rp立即放在42℃水浴60min70℃终止反应5min。再准备青鱼生长激素cDNA片段克2μL(1μg/μL10×PC2.5μL25mmo1.5μL10mM/μLP1P21μL10mM/μL1μL5U/μLμLdH3min94℃1min551min72℃1min310min4[0060]PCRpEASY-T1cloningvector(PCR克隆出了青鱼生长激素。5’3pPIC3.5K-[0062]cDNApPIC3.5K-GHF，pPIC3.5K-GHRPCRPCR体系：东盛生物科技公司提供的2X1mL规格的2×PCRTaqMix12.5μL10mM/μLpPIC3.5K-GHF和pPIC3.5K-GHR各1μL1μg/μL)cDNA2μ添加ddH2O至25μLPCR扩3min94℃1min55℃1min72℃1min3010min410min。PCR产物经凝胶回收试剂盒纯化后，用EcoRINotI双酶PCRPCREco鉴定为阳性的克隆进一步分析。将获得的阳性重组质粒命名为pPIC3.5K-bcGH，结果见2(Lane1-6pPIC3.5K-bcGHEcoRI和NotILaneMDNAmarker)[0063]酵母感受态的参考文献(FrederickMA1995)[6]。于液氮中取出Gs115酵母立即置于冰性化的pPIC3.5K-bcGH重组载体(5～10μg)与Gs115酵母(购自宝生物工程(大连))感受态混转入预冷的0.1cm电转杯在冰上放5min按电600V400Ω25μF的条件进行电立即加入1mL预1M山梨醇至杯MD(200μL每平板303～4d至克隆(His+转化子)产生。把MD平板上的pPIC3.5K-bcGH酵母转化子进行YPD平板(G418的浓度分别为1.02.0和3.0mg/ml)梯度筛选多拷贝，303～4d。把生长良好的高抗性转化2.0mg/mlPCR法筛选阳性转化子。结果见3(Lane1～4PCRLaneMDNAmarker)6.030℃300r/minMMarkerLan4.55.56.06.5，7.05(Lane1～648LaneMMarker)。[0065]QIAGENNiSepharoseHighPerformance3kD1L0.9％NaCl4℃透析。透析后的样品进行SDS电泳和蛋白质定量。以鼠抗青鱼生长激lgG3’3’5’5’-四甲基联苯胺[TMB]。分别用免疫前的小鼠和PBST作对照和空白对照。重组酵母工程菌Gsl15在pH6.5的培2hNi-TManticAaoseBad带6x组氨酸的重组青鱼生长激素多肽。经过亲和吸附后只留下经诱导的菌株表达的青鱼生长6200040008000倍、64000倍，一抗分别稀释1000倍、2000倍、4000倍、8000倍，同时做对照和空白对照[0066]1bcGHElisa 酶标仪测定在A450nm下的吸光作成标准曲线见图7测得镍凝胶亲和层析纯化的bc-GH酵母菌液接种量pH发酵时间诱导剂(即甲醇)浓度六个单因素对蛋白的表达量的[0071]工程酵母菌培养方法[0072]1)菌种活80℃冰箱保藏的重bcGH酵母菌种划线转MD平板30温倒置培养3-5天，以检测His+转化子的表型是否正确及其。[0073]2)培养：接1环生长良好的MD平板至装有50mL培养基的500mL摇瓶中，重复做6个摇瓶，置于300rpm恒温摇床，30℃振荡培养菌液OD600至2-6(时间为10-24小时)，作为发酵用的液。 根据Box-Behnken的中心组合设计原理以上六个因素为自变量以目的蛋白的)) 发酵条件的单因素探索I在填装量7L的10L发酵罐中，30℃pH6.50.5％诱导剂5％接种量5％大米蛋白300rpm的条件下探索发酵时间对外源蛋白表达的影响(12h24h48h72h96h)结果见图8(Lane1未诱导Lane2蛋白质MarkerLane3～7诱导时间分别为96h72h48h24h12h)II在填装量7L的10L发酵罐中pH6.50.5％诱导剂发酵72h5％接种量5％大米蛋白300rpm的条件下探索培养温度对外源蛋白表达的影响(24℃26℃28℃30℃32℃)结果见图9(Lane1蛋白质MarkerLane2～6：发酵温度分别为32℃30℃28℃26℃24℃Lane7未诱导)。III在填装量7L的10L发酵罐中温度30℃pH6.50.5％诱导剂发酵72h5％大米蛋白300rpm的条件下探索接种量对外源蛋白表达的影响(2％3％4％5％6％)结果见图10(Lane1未诱导Lane2～6接种量分别为2％3％4％5％6％Lane7蛋白质Marker)。 ILan0.5％LanLanepHLane 425255[0078]2bcGH[0081]3bcGH[0084][0085]10L其在发酵罐中的发酵效果。空气流量为3L/min搅拌速度为300r/min在大米蛋白浓度7温度30pH6.5接种量6诱导剂浓度1％条件下诱导发酵96h。发酵结总蛋白的32.39％。[0087]此外，还发现在大米蛋白浓度5-7％，发酵温度28-30℃，pH6.0-7.5[0088][0089]生长激素工程酵母菌液体发酵大米蛋白混合物的喷雾干燥研 I1.10m3/min12.00ml/min的条件下，研究随着进风温度不同对bcGH工程菌存活率的影12.00ml/minbcGH(1.00m3/min1.10m3/1.10m3/minbcGH(8ml/min10ml/min、12ml/min14ml/min6。 平组合条件下的工程菌存活率指标进行极差分析，确认最佳的干燥工艺条件。根据表81.10m3/min12.00ml/min110-1301.00- 7 8 以初始平均体重1g3.0％、6.0％9.0％12.0％和15.0％工程菌发酵大米蛋白(即本发明生长激素工程酵母菌0.1mg/LpH 9 [0114]相对增重率＝末重×100饲料系数＝总投饲初重)；(％)＝试验初鱼尾数/试验末鱼尾数×100。[0115][0116][1]Donaldson，E.M.，U.H.M.Fagerlund，D.A.HiggsandJ.R.McBride.Hormonalenhancementofgrowth.InFishPhysiology(edsW.S.HoarD.J.RandallandYorkNY19798456-[0117][2]HertzYTcheletAMadarZ，etal.Absorptionofbioactivehumangrowthhormone