培养基的制备与高压灭菌

培养基的制备与高压灭菌第1页，共23页，2023年，2月20日，星期四微生物基础实验注意事项1、提高安全意识，正确操作仪器；2、培养无菌操作的观念；3、自觉清洗器皿；4、注重保持环境卫生和实验室秩序；

第2页，共23页，2023年，2月20日，星期四培养基的制备与灭菌

一、目的：

1、学习一般培养基的制备方法；

2、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用的灭菌方法。第3页，共23页，2023年，2月20日，星期四

二、原理

1、培养基(culturemedium)：培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的一种基质。

培养基的种类：根据培养基的成分可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基；按物理性状不同，可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。第4页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑴天然培养基：主要成分是天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。适用于生产上大规模培养微生物。

⑵合成培养基：成分明确的化学药品配制而成的培养基。如：高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、营养代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。

⑶半合成培养基：在天然有机物的基础上，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基。具有广泛的应用，如马铃薯葡萄糖培养基，适合很多霉菌的生长。第5页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑴液体培养基：配好后成为液体状态的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。广泛用于理论研究和大规模的工业发酵。

⑵固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂形成的固态培养基。常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶。硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、菌种保藏等。⑶半固体培养基：在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如，加入0.2-0.7%琼脂作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、鉴定菌种、菌种保藏和噬菌体的效价滴定等。第6页，共23页，2023年，2月20日，星期四

根据培养基的特殊用途分类：

⑴基础培养基：含有一般细菌生长繁殖所需的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。

⑵加富培养基：是在基础培养基中加入血、血清、动物组织提取液或植物组织提取液，主要用于培养某些对营养要求较为苛刻的微生物。第7页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑶选择培养基：根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。①根据某些微生物对碳、氮源的特殊要求来设计选择性培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物。②在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加10%的酚数滴可抑制细菌和霉菌的生长。

⑷鉴别培养基：在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，使培养的微生物产生某种代谢产物与该化合物或化学试剂发生明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将此种微生物与其他种微生物区别开来，如伊红美蓝培养基。第8页，共23页，2023年，2月20日，星期四2、灭菌：消毒与灭菌是两个不同的概念。

消毒：一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而不能杀死全部芽孢，因此，消毒对微生物的杀灭是不彻底的，而且往往只能作用到物体表面，只能作为一般的卫生措施。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法对器械的表面消毒处理，用紫外灯对房间进行照射等。

灭菌：杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子，因此，灭菌后的物品不再带有活体微生物。灭菌的方法很多，如加热(干热或湿热)、过滤等。第9页，共23页，2023年，2月20日，星期四⑴干热法灭菌：a)

火焰烧灼：适用于接种环、接种针、镊子等金属用具，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。

b)热空气灭菌：使用电热干燥箱，借助热空气在160-1700C下保温2小时进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，对带胶皮的器物或培养基不适用。第10页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑵湿热灭菌：a)高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15—30分钟进行灭菌。这种灭菌适用于培养基等的灭菌。

b)间歇灭菌法

少数培养基，例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等，高温高压灭菌易被破坏，适用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下18-24小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热1000C，30分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。第11页，共23页，2023年，2月20日，星期四

三、材料：

1、药品：NaCl蛋白胨牛肉膏可溶性淀粉K2HPO4HClNaOH琼脂葡萄糖蔗糖Na2SO4

黄豆芽马铃薯伊红美蓝等。

2、器材：台秤三角瓶试管漏斗电炉搪瓷杯（铝锅）试管架玻棒滴管称量纸pH试纸棉花纱布牛皮纸棉线灭菌锅干燥箱等。第12页，共23页，2023年，2月20日，星期四

四、方法及步骤：

1、培养基的配制一般可分为称量、溶化、pH调节、过滤和分装等步骤

⑴称量：按照培养基配方，称取各种成分；⑵溶化：在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分，依次将各成分加入，使全部溶解，最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时，需加热溶解，并补足水分。配制固体培养基时，先将上述配好的液体培养基加热到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热到琼脂完全熔化，在加热过程中要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢。第13页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑶矫正pH值：初配制好的培养基，往往不能符合所需求的pH值，故必须矫正，用精密pH试纸，以1NHCl或1NNaOH调节至所需要的pH值。

⑷过滤：用滤纸、棉花或双层纱布过滤。

⑸分装：将制成的培养基分装于三角瓶或试管内。第14页，共23页，2023年，2月20日，星期四马铃薯糖琼脂培养基(PDA)

成分：马铃薯200g

蔗糖20g

琼脂25g

水补足1000ml

方法：将马铃薯洗净去皮切块，放入搪瓷杯中，掺适量水加热煮沸30分钟（注意不时用玻棒搅拌，避免糊底），用双层纱布滤去薯块，在薯汁中加入琼脂，加热熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水补足体积，趁热分装到三角瓶中，121℃灭菌20min。

注：无须调pH值，保持自然的酸性。第15页，共23页，2023年，2月20日，星期四伊红美蓝琼脂培养基(EMB)

成分1：蛋白胨10gNaCl5g

乳糖4g

琼脂25g蒸馏水1000mlpH7.6

成分2：2%伊红水溶液2ml，0.5%美蓝水溶液1ml

方法：先配成分1，调好pH值后才可加入成分2，混匀，趁热分装到三角瓶中，115℃灭菌20min。第16页，共23页，2023年，2月20日，星期四3倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基

成分1：蛋白胨30g

牛肉膏9g

乳糖15gNaCl

15g蒸馏水

补足1000mlpH7.2

成分2：1.6%溴钾酚紫乙醇溶液3ml

方法：先配成分1，调好pH值后才可加入成分2，混匀，分装到三角瓶及大试管中，并加入倒置的事先充满该培养液的杜氏管（勿留气泡），封口后115℃灭菌20min。第17页，共23页，2023年，2月20日，星期四

2、灭菌：⑴干热灭菌步骤：

①将要灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。②接通电源，打开开关；旋动恒温调节器至1400C，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。③两小时后，关掉电源，当温度降至600C以下后，才可打开箱门，取出灭菌物品。第18页，共23页，2023年，2月20日，星期四（2）高压蒸汽灭菌

原理：在密闭容器中加热形成的蒸汽不断堆积，使蒸汽压力升高，温度也相应升高，超过水的沸点。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15~30分钟进行灭菌，就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。第19页，共23页，2023年，2月20日，星期四手提式蒸汽灭菌锅立式蒸汽灭菌锅（电加热、自动或半自动）卧式蒸汽灭菌锅第20页，共23页，2023年，2月20日，星期四高压蒸汽灭菌锅的使用：

①锅内加入适量的水，使水面与三脚搁架相平为宜。②把要灭菌的材料装入锅内，注意不要放得太挤，防碍蒸汽流通，影响灭菌效果。③盖好灭菌锅锅盖，按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓，螺栓松紧一致，以免漏气。④打开电源，开启排汽阀，以排除锅内的冷空气。⑤待冷空气完全排尽后，关闭排汽开关。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时。控制热源，维持压力至所需时间。本实验根据培养基不同，分别采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分钟；0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分钟。第21页，共23页，2023年，2月20日，星期四

⑥灭菌所需时间到后，关闭热源。⑦让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至“0”时，打开排汽阀。⑧打开灭菌锅盖，取出已灭菌的物品及培养基。第22页，共23页，2023年，2月20日，星期四五、培养基的配制及器材准备：

1：配牛肉膏蛋白胨固体培养基2000ml，分装于16个250ml三角瓶；2：配牛肉膏蛋白胨固体培养基500ml，分装于100支试管；3：高氏1号固体培养基1000