微生物检测作业指导书

微生物检测作业指导书第1页/共54页培养基与试剂制备培养基的实验室制备

培养基的使用第2页/共54页培养基的实验室制备1、概述使用脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵循良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。如质量体积、pH、制备条件、灭菌条件和操作步骤等。2、水配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，以排除测试条件下抑制或影响微生物生长的物质。如果蒸馏水是用氯消毒的水制备的，在蒸馏前应先对氯进行中和（见GB/T6682）盛放蒸馏水的容器最好是中性材料制成的（如中性玻璃、聚乙烯等），在初次使用前腰确认容器中不含有任何抑制因子。注：有时需使用新制备的蒸馏水，避免水中溶解的二氧化碳。为保证蒸馏水的质量，蒸馏水的电阻率最少应达到300000Ωcm3、称量和复水称量所需量的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。4、培养基的溶解脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。第3页/共54页5、培养基pH的测定和调整商品化的培养基高压灭菌前后pH值可能变化不大。但采用优质蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前无需调节pH值。6、培养基的分装将配制好的培养基分装到适当中，根据不同用途，容器的体积可为培养基的1倍、2倍或3倍。7、培养基的灭菌湿热灭菌在高压锅或制备培养基的容器中进行，高压灭菌一般采用121℃灭菌15min。当培养基体积超过1000mL时，要对灭菌条件进行适当的调整，但应按照标准或使用说明的规定进行。灭菌过程要通过放置到特定位置的热电藕或测试条进行检测，以保证灭菌的效果。注：大容量（＞1000mL）的培养基灭菌时可能造成过度加热。灭菌效果的控制是关键。加热后采用适当的方法冷却，以防加热过度。这对于肠道菌培养基和大容器中的培养基等的灭菌十分重要。8、培养基的监测应对经湿热灭菌的培养基进行监测，尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。第4页/共54页培养基的使用1、琼脂培养基的融化将培养基放到沸水浴中或采用相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。经过高压的培养基应尽量减少重加热时间，避免过度加热。培养基溶化后放入47℃±2℃的恒温水浴锅中保温，直至使用。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。2、培养基的脱气必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度。3、平板的制备倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好后放到水平平面使琼脂冷却凝固。注：在培养过程中，培养基会损失水分。当水分损失的量大于培养基总量的15%时，就会影响微生物的生长。造成培养及水分损失的因素很多，如培养基成分，平皿中培养基总量和培养箱的类型等（如使用带风扇的培养箱，培养箱中的湿度偏低，平板在培养箱中放置的位置靠近加热管，培养温度过高等），操作时应注意避免。第5页/共54页4、平板的储存凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按厂商提供的标准执行。在平板底部做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可以使用适宜的培养基编码系统进行标记。将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长贮存期限。为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养，应先对琼脂表面进行干燥；揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱/培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。5、平板的培养培养时每垛最多堆放六个平板，平板间要留有空隙以保证空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致；液体培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养类型等；使用厌氧罐时，堆放的平板数可以超过六个。第6页/共54页微生物无菌室基本要求及管理

1无菌室的基本建设要求1.1根据本实验室所涉及的生物安全等级，无菌室的设计和建设应符合GB50364和GB19489的相关要求。1.2无菌室大小应能够满足检验工作的需要，内墙为浅色，地面和地面应光滑，墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，无死角，易于清洁和消毒。1.3无菌室入口处应设置缓冲间，缓冲间内应安装非手动式开关的洗手盆，并可有毛巾。缓冲间应有足够的面积以保证操作人员更换工作服及鞋帽。1.4无菌室内工作台的高度约80cm,工作台应保持水平，工作台二应无渗漏，耐腐蚀，易于清洁、消毒。1.5无菌室内关照应分布均匀，工作台面的光照度应不低于540Ix.1.6无菌室应具备适当的通风和温度调节的条件。无菌室的推荐温度为20℃，相对湿度为40%～60%。1.7缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置。第7页/共54页微生物无菌室基本要求及管理2无菌室的管理2.1无菌室在使用前和使用后应进行有效的消毒。2.2无菌室的灭菌效果应至少每两周验证一次。2.3应制定清洁、消毒、灭菌、使用和应急处理程序。2.4应记录环境检测结果，并归档保存。2.5不符合规定时应立即停止使用。第8页/共54页微生物实验室消毒处理方法

1无菌室1.1紫外线消毒1.1.1在室温20℃～25℃时，220V30W紫外灯下方垂直位置1.0m处的253.7nm紫外线辐射强度应70W/cm2,低于此值时应更换，适当数量的紫外灯，确保平均每立方米应不少于1.5W。1.1.2紫外线消毒时，无菌室内应保持清洁干燥。1.1.3在无人条件下，可采取紫外线消毒，作用时间应30min，室内湿度20%或40%、相对湿度大于60%时，应适当延长照射时间。1.1.4用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。1.1.5人员在关闭紫外灯至少30min后方可入内作业。1.1.6按照GB15981的规定，评价紫外线的消毒与杀菌效果。第9页/共54页1.2臭氧消毒1.2.1封闭无菌室内，无人条件下，采用20mg/m3浓度的臭氧，作用时间应30min。消毒后室内臭氧浓度0.2mg/m3时方可入内作业。1.2.2按照GB/T18202的规定，检测室内臭氧的浓度。1.3无菌室空气灭菌效果验证方法（沉降法）1.3.1在消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。1.3.2取样点的选择应基于人员流量情况和做试验的频率。一般情况下，无菌室面积30m2时，从所设定的一条对角线选取3点，即中心1点，两端各距离墙1m处各取1点；无菌室面积30m2时，选取东南西北中5点，其中东点、南点、西点、北点均距离墙1m.第10页/共54页培养基和试剂灭菌2.1培养基通常应采用高压湿热灭菌法，121℃灭菌15min，特殊培养基按使用者的特殊要求进行灭菌（如含糖培养基，115℃灭菌20min。）2.2部分培养基（如嗜盐琼脂培养基，胆硫乳培养基等），只能煮沸灭菌。2.3对热敏感的培养基或添加物质，应采用膜过滤方法进行过滤除菌。2.4即用型试剂不需灭菌，应参见相关国际标准或供应商使用说明，直接使用。第11页/共54页器具和设备灭菌3.1湿热灭菌：采用高压灭菌器，121℃灭菌20min,适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等按照GB15981的规定，评价高压灭菌器的杀菌效果。3.2干热灭菌：采用干燥箱灭菌，160℃灭菌2h,180℃灭菌1h,适用于玻璃器皿，不锈钢器具等。3.3液体消毒剂消毒：使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂（参见表D.1）对工作台面、器具或设备表面进行消毒。可按照GB15981的规定，评价自配或商业消毒剂的消毒效果；可按照ISO18593,监测工作台面、器具或设备表面的消毒效果。第12页/共54页实验室废弃物处理

1对于培养物及其污染的物品（如斜面，用过的吸量管、细菌培养皿等），应使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂（参见表D.1）对处理后一定时间，或121℃高压灭菌至少30min，或者其他有效处理措施。将处理物倒入特殊标识的垃圾袋内，直接送到指定地点。2对于实验动物尸体及相关废弃物，按照GB14925的规定进行处理。3记录并保留废弃物和处理的记录。第13页/共54页某些消毒剂的特性

第14页/共54页大肠菌群MPN计数的检验程序第15页/共54页从土壤分离微生物的操作过程第16页/共54页平板接种操作方法第17页/共54页大肠菌群最可能数（MPN)检索表第18页/共54页生产环境卫生指标装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2500cfu/m3工作台表面细菌菌落总数应≤20cfu/cm2工人手表面细菌菌落总数应≤300cfu/只手，并不得检出致病菌。第19页/共54页工作台面与工人手表面采样与测试方法

样品采集工作台：将经灭菌的内径为5cm×5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用以浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。工人手：被检人五指并拢，用以浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。细菌菌落总数检测将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1mL样液，放入灭菌平皿内，倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两个平皿，置35℃±2℃培养24h培养48h,计数平板上细菌菌落数。第20页/共54页细菌菌落总数检测计算公式第21页/共54页空气采样与测试方法样品采集在动态下进行。室内面积不超过30m2，在对角线上设里中外三点，里、外点位置距墙1m；室内面积超过30m，设东西南北中5点，周围4点距墙1m。采样时，将含营养琼脂培养基的平板（直径9cm）置采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平板在空气中暴露5min。细菌培养在采样前将准备好的营养琼脂培养基置35℃±2℃培养24h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。将已采集的培养基在6h内送实验室，于35℃±2℃培养48h,观察结果，计数平板上细菌菌落数。第22页/共54页空气细菌菌落总数计算公式第23页/共54页压力蒸汽灭菌温度和时间压力蒸汽灭菌器 压力，MPa/cm2

温度，℃灭菌时间，min下排汽式 0.070 115 400.105 121 30预真空式 0.210 134 4～6第24页/共54页第25页/共54页第26页/共54页第27页/共54页实际使用的培养基和试剂的配制

试剂的配制

培养皿和吸量管的杀菌试剂的杀菌第28页/共54页试剂的配制

1、无菌生理盐水的配制。用精确到0.01g的电子称称取8.5g微生物检测专用盐，在100ml烧杯中用二次净化水溶解后，转移到1000ml的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000ml备用。2、营养琼脂培养基的配制称取35g营养琼脂培养基用二次净化水在250ml的烧杯中溶解后，转移到1000ml的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000ml。然后用250ml的锥形瓶分装备用。第29页/共54页3、孟加拉红琼脂培养基的配制称取36g营养琼脂用二次净化水在250ml的烧杯中溶解后，转移到1000ml的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000ml。然后用250ml的锥形瓶分装备用。4、乳糖胆盐肉汤的配制称取36g营养琼脂用二次净化水在250ml的烧杯中溶解后，转移到1000ml的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000ml。然后用250ml的锥形瓶分装备用。第30页/共54页培养皿和吸量管的杀菌培养皿将培养基处理完，用84消毒液浸泡30min后，用洗洁精清洗干净后用干燥箱烘干（160℃、30min）后，用报纸包扎好，在160℃干热杀菌2小时。1ml的吸量管也用84消毒液浸泡30min后，用洗洁精清洗干净后用干燥箱烘干（160℃、30min）后，用报纸包扎好，在160℃干热杀菌2小时。第31页/共54页试剂的分装（1）生理盐水的分装。将配置好的生理盐水用500ml的量筒按照每个锥形瓶装225ml的量进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用报纸将瓶口包扎好。（2）营养琼脂的分装将配置好的营养琼脂用500ml的锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用报纸将瓶口包扎好。（3）孟加拉红琼脂的分装将配置好的营养琼脂用500ml的锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用报纸将瓶口包扎好。（4）乳糖胆盐肉汤的分装将配置好的乳糖胆盐用10ml的量管分装在玻璃试管中，试管规格为15*150mm，锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用报纸将瓶口包扎好。第32页/共54页试剂的杀菌（1）生理盐水的杀菌。将分装完毕的生理盐水，放在杀菌釜内，摆放好。然后关上杀菌釜，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，杀菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待杀菌釜内气压全部排净完后打开杀菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间的小窗内。（2）营养琼脂的杀菌将分装完毕的营养琼脂，放在杀菌釜内，摆放好。然后关上杀菌釜，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，杀菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待杀菌釜内气压全部排净完后打开杀菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间预处理间的水浴锅，进行保温，水浴锅的温度46±1℃。第33页/共54页（3）孟加拉红琼脂的杀菌将分装完毕的营养琼脂，放在杀菌釜内，摆放好。然后关上杀菌釜，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，杀菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待杀菌釜内气压全部排净完后打开杀菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间预处理间的水浴锅，进行保温，水浴锅的温度46℃±1℃。（4）乳糖胆盐肉汤的杀菌将分装完毕的乳糖胆盐发酵管，放在杀菌釜内，摆放好。然后关上杀菌釜，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，杀菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待杀菌釜内气压全部排净完后打开杀菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间的小窗内。第34页/共54页微生物实验操作实验前准备

实验操作

第35页/共54页实验前准备1无菌操作台和微生物操作间杀菌消毒。每次做实验之前，用75%的酒精对无菌操作台和微生物操作间进行喷洒消毒，然后开启无菌操作台上面的紫外灯对无菌操作台杀菌30min以上。同时，开启微生物操作间紫外灯对空气杀菌消毒30min以上。2、微生物检验人员的工作服、帽、口罩和鞋子的杀菌。微生物检验人员的工作服、帽、口罩和鞋子在实验之前，在微生物操作缓冲间用紫外灯杀菌30min以上。操作人员在进入微生物操作间时，先用香皂清洗手，然后用消毒好的毛巾擦干手，再用75%的酒精对手进行喷洒杀菌。3、营养琼脂和孟加拉红培养基外表面的杀菌。营养琼脂培养基在拿进微生物操作间时，先用75%的酒精喷洒消毒，因为锥形瓶外表面容易长菌，同时在打开锥形瓶塞是用酒精灯对瓶塞外表烤一边进行杀菌。微生物操作时，倒平板时，培养皿应该靠近酒精灯，同时每次对锥形瓶口烤一下。4、乳糖胆盐发酵口和样品的口杀菌。第36页/共54页实验操作第37页/共54页实验结果的报告菌落总数的计数可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。选取菌落数在30CFU到300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30CFU平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。2、菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数的结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按公式计算若所有稀释度的平板上菌落数大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数均不在30CFU300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3、菌落总数的报告菌落数小于100CFU时，按照“四舍五入”原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。第38页/共54页实验结果的报告霉菌和酵母菌计数可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。选取菌落数在10CFU到150CFU的平板、根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可数。菌落数应采用两个平板的平均数。5、霉菌和酵母菌菌落总数的计算方法计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数小于10CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。6、霉菌和酵母菌菌落总数的报告菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。第39页/共54页培养基常见问题培养基不能凝固

pH值不正确产生沉淀颜色异常培养基出现抑制重复性差选择性差第40页/共54页培养基不能凝固的原因制备过程中过度加热；低pH值造成培养基酸解；称量不正确；琼脂未完全溶解；培养基成分未充分混匀；第41页/共54页培养基pH值不正确的原因制备过程中过度加热；水质不佳；外部化学物质污染；测定pH值时温度不正确；pH计未正确校准；脱水培养基质量差；第42页/共54页培养基产生沉淀的原因制备过程中过度加热；水质不佳；脱水培养基