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文档简介

肿瘤微环境中腹腔巨噬细胞的流式检测方法步骤准备：大小BD管，10ml空针，1ml空针，无菌生理盐水或PBS，红细胞裂解液（4度冰箱保存）。流式管若干。流式抗体：CD45，CD11b，F4/80，CD206，每种抗体均有4中不同的颜色（Percp-cy5.5,APC,FITC,PE),选抗体颜色时每种抗体颜色不能重复（需要提前一天或半天检查抗体是否足够，若不够，需及时向管家补齐，此点很重要！）。各种型号的枪和枪尖。冰盒（有盖的，可以避光）。离心机。收集腹腔细胞：15mlBD管收集腹水或腹腔灌洗液，离心（1500rpm，3min），弃上清。裂红：若腹水中有红细胞时则裂红，若无，则省略此步骤。方法：红细胞裂解液4ml-8ml，冰上裂解3-10min，离心，弃上清。PBS4ml洗一次。说明：根据红细胞多少决定裂红液的量和时间，但时间不能过长。若一次没有裂干净，最好先离心，用PBS洗之后再裂第二次，裂红液持续作用的时间不能过长。PBS重悬：1ml重悬，细胞计数（按魏老师的说法是需要计数的）。将BD管中的细胞转移至流式管中，每个流式管的细胞约1x106个。一般情况，每只老鼠腹腔细胞是多于1x106个的，剩下的细胞可作为单染或空白管的细胞来源。孵抗体：巨噬细胞膜上直标抗体选择CD45，CD11b，F4/80，CD206，冰上避光孵育30min，之后的步骤均避光较好。说明：染色分为：样品管，空白管，单染管。样品管每种抗体加1ul，如9个样品管，可先将每种抗体10ul，加入干净的小ep管中混匀后，再每个样品管加4ul。空白管和单染管的细胞由每个样品的剩余细胞混合而成。空白管即什么都不染。单染管只加一种抗体，如CD45单染管只加CD45抗体。PBS1ml洗一次。PBS重悬，novocyte上机：根据细胞量的多少，加入200-300ulPBS重悬。多则多加，少则少加。腹腔巨噬细胞流式结果分析NatureImmunology

15,

333–342

(2014).

JelenaSBezbradica,etal.ArolefortheITAMsignalingmoduleinspecifyingcytokine-receptorfunctionsBlood

2013

121:1839-1849.Daisuke

Kurotaki,etal.EssentialroleoftheIRF8-KLF4transcriptionfactorcascadeinmurinemonocytedifferentiationF4/80CD11b圈门方法注意事项1/提取腹腔细胞至细胞染色时间不能太长，因细胞放久了不好，另外巨噬细胞可能发生变化，比如说它可以吞噬红细胞，向II型转

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