终稿基因B在肿瘤组织中过表达原因分析

化学生物学课程设计B高表专

业：化学生物学学生姓名：方晟，杜宾，房蕾，王芳琴，尹先珍指导教师：马亮，刘时

间：年月10

目录第一部分：背景介绍（方晟1第二部分：实验思路与计划（方晟一、实验思路二、实验计划第三部分：相关实验方5一、表达载体相关方法（杜正宾）二、RNA干扰技术（房蕾三、启动子与转录因子分析（王芳琴）四、免疫组化（尹先珍）33五、表观遗传（尹先珍）41附：排版：方晟

第一部：景介绍

（方晟）世界卫生组织2月发表的《全球癌症报告2014》中称2012年中国新增癌症病例高居第一位中国虽然发病率低于发达国家但是新增和死亡病例居世界第一性易发肺癌和肝癌乳腺癌在全球女性中成最高发癌症2012年新增癌症病例有近一半来之亚洲，其中大部分在中国。肺、肝、食道、胃等4恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。因此，癌症治疗形势刻不容缓。现阶段，癌症主要治疗方式以外科切除手术、放射线治疗和化学治疗为主，但严重的副作用使得病人在治疗过程中极其痛苦。因此，寻求癌症的治疗手段，开发治疗癌症的药物，已经成为世界最具有前景和潜力的研究方向，以基因为主轴的治疗方式发特异性靶向癌细胞的基因药物已经成为开发治疗癌症药物的主流所谓靶向治疗是指以标准化的生物标记物来识别是否存在某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因或基因谱以此确定针对特异性靶点的治疗方法是在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用使肿瘤细胞特异性死亡而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹癌症是复杂的多基因疾病究癌症发病机制找癌症相关蛋白异常表达、开发针对特定癌症相关靶蛋白的药物开发成为目前抗癌药物设计与研究的重要方向。通过比较肿瘤组织和正常组织中基因B表达量发现，基因B在肿瘤组织中特异性高表达，而在正常组织中表达水平低，可能基因B高表达与癌症发生相关，也可能成为治疗癌症的靶点。本课题是研究肿瘤组织中某基因B的过表达原因，想以此阐述基因B与癌症之间相关关系，为研发靶向该基因B相关通路蛋白的抗癌药物提供研究思路和方向。第1页

第二部：究思路计

（方晟）基因表达调控是维持细胞正常活动的基础，中心法则告诉我们，可经转录成，RNA翻后形成蛋白质，蛋白质作为生活动主要承担者，进行新陈代谢、维持细胞形态等生命活动研究某基因在肿瘤组织中高表达原因必首先要弄清基因表达的过程和调节过程下图展示基因达调控的不同层次后可以根据不同层次的研究探索基因竟在何水平调节下高表达。图不水平上的基因表达调控一、本课设计思路本课程设计主要是在转录水平探索基因B过表达原因基在相关信号网络中分析基因B上游基因与基因B相关系研设定上游基因为基因游因为基因D）1.1查文献，是否有基因B与下游基因或D相关研究1.2基C或D高达所使用方法：表达载体构建检测指标：基因B、因或D达蛋白量1.3基C或D敲或沉默所使用方法：RNAi技检测指标：基因、基因或表蛋白量若出现阳性结果，则进一步研究肿瘤组织中基因或D的关表达量和调控。方法和本课题相关方法一致，是重复研究，直到最终确证原因。基相转录因子分析寻找基因B相转录因子，基因B与关转录因子关系研究2.1查文献，是否有基因B与相关转录因子关系研究2.2基动子分析所使用方法：启动子分析软件目的：寻找基因B相关可能转录因子2.3基关可能转录因子验证第2页

所使用方法：同1.2和1.3.即高表达或者沉默基因B相可能转因子，所使用手段与1.2、1.3相需要研究相关可能转录因子是否在该肿瘤组织中高表达。其分析RNA剪RNA稳性研究，翻译因子调控，蛋白活性调节，蛋白质稳定性和降解机制，表观遗传等转录前水平：表观遗传相关甲化，乙化等信号网络调节：上下游基因与基因B关基因B过

转录水平（重点）

转录因子与启动子分析表达原因二、实验划

转录后水平：接，RNA稳性相关翻译水平：翻译因子相关研究翻译后水平：蛋白活性调节，蛋白稳定性与降解图研思分析L1

进行基因B相生物信息学分析，分析其在肿瘤基因组中的置，序列上下游信息等目的：为后期实验做准备。L2

检测基因B在常组织和肿瘤组织的mRNA表含量方法：，NorthernBlot目的：该实验验证区分基因B表究竟是转录前，转录水平还是转录后，翻译，翻译后水平上的调节结果预测若常组织和肿瘤组基因B的mRNA水平抑制那就说明可能不是录调控相关的调控，反之，肿瘤组织基因水高，那么说明在转录前或者转录调控过程中，该基因B在肿瘤组织与正常组织中不同，可能高表达与转录调控有关。L3

构建基因C或D的达载体，细胞转染到肿瘤胞中，培养后检测基因CD，因B的达产物含量方法：表达载体构建和细胞转染转化相关实验NorthernBlot，Blot等目的：高表达基因B上下游基因，看基因B达量，看上下游信号与基因B是有相关。结果预测：与对照组比较，若基因B高表达，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。L4

设计并构建基因或的shRNA的病毒载体，细胞转染，利用WesternBlot检shRNA功，而后，选取最佳设计的的慢病毒载体，转到肿瘤细胞中，培养后，检测基因或，基因B的表达产物含量方法：RNAi技相关实验，慢病毒载体构建，细胞转染Blot，WesternBlot等第3页

目的基沉默基因B上游基因看基因B表量看上下游信号与基因B否有相关。结果预测：与对照组比较，若基因B表达水平相对低，则可能与上下游基因相关，反之，则可能无关。L5

基因B启动子分析与软件预测转录因子，而后，查找预测的转录因子是否在该肿组织中高表达，而后，选出备选方案，将备选的转录因子利用L4似的步骤进行RNAi干扰沉默，随后检测备选转录因子含量，基因B表产物含量方法：启动子分析预测软件术相关实验，细胞转染NorthernBlot，WesternBlot等目的：寻找基因B的转录因子并验证。结果预测：若沉默该转录因子后，基因B表达水平相对变低，那么，测说明可能该转录因子与基因B表相关。反之，则可能无关。若全部筛选完转录因子后都是基因B表水平和肿瘤组织中差不多，那么，可能与转录因子无关。L6

启动子与转录因子相关性能分析方法：酵母双杂交技术，电泳迁移实验WesternBlot等目的：检测与目标转录因子结合的蛋白的结果预测：可通过上述的wensternblot等法检测与目标转录因子结合的蛋白的表达量，若高表达则可能是转录激活因子，若低表达则可能是转录抑制因子。而后可以进一步分析转录因子相关的信号通路啦。不断验证。以下可能做，L7

表观遗传相关实验目的：探究基因B在瘤组织中，是否通过表观遗传方式激活。若2结为阴性，为选出后续可能在转录后水平或翻译水平，翻译后水平，可能进行的实验L8

基因转录组测序与基因组测序，以及进行比。目的：比对分析，为后续实验指导相关信息L9

基因B表达产物蛋白的免疫沉淀实验目的：筛选出与基因B相作蛋白，以此来分析蛋白活性调节与是否与蛋白降解相关还有很多其它方法，时间有限，这里就不例举说明了。其实整个基因高达相关的调节机制有很多，可能是基因B表来路上调，也可能是基因B表产物去路阻滞。统分根据每个实验，设置对照组和空白组，平行实验3次计算R值，小0.05具有统计学意义。第4页

第三部：关实验法一、表达体相关方法物计

（杜正宾引物设计是一小段单链或RNA，作为复的起始点，在核合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3上核酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3-OH必须是游离的。1.1引设原1.1.1长—，其有效长[Ln=2(G十十(A十T)]一不大于，否则PCR的适延伸温度会超过酶最佳作用温(度)，从而降低产物的特性。十含：应在40%之间，PCR扩中的复性温度一般是较低值物的减去—10。引物长度小于20时其恒于4十C)十×(A。1.1.3碱分布的随机性应免连续出现4个以上的单一碱基尤其是不应在端出现超过3个连续G，则会使物在G十C富序列区错误引发。1.1.4引自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。1.1.5引之间：两个引物之间不应有多于的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。1.1.6上游引物的互补性引的端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。1.1.73’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C1.1.8引应当超出限制性内切酶识别位点至少个苷酸。1.2.引物计件软件的引物设计功能主要体现在两个方面先引物分析评价功能功只有少数商业版软件能够做到，其中以”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以PremierPrimer”为最强且方便使用6其次，其他软件如“SuitDNAsis”和“Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。引物设计软件的最佳搭配是“”“Premier”件合并使用，以“Premier”进行自动搜索Oligo”行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。“Premier”的主要功能分四大块其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和基元(motif)查找Premier”还具有同源性分析功能，但并其特长，在此略过此，该软件还有一特殊功能中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读与白序列的互换、语音提示键盘输入等等。1.2.2Oligo6.22在专门的引物设计软件中Oligo”是最著名的。它的使用并十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。5.0的始界面是两个图Tm图和G图6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图”功能比“”要单一就是第5页

引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。PCR聚酶链式反应利在外氏95°高温时变性会变成单链经常是60C右时引物与单链按碱基互补配对的原则结合再调温至合酶最适反应温度（°左DNA聚酶沿着磷酸到五碳糖5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的仪实际就是一个温控设备，能在变性温度复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。2.1标的过分三：DNA变（℃℃链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链退（℃℃统度降低，引物与模结合，形成局部双链。延（℃℃Taq酶（在℃左右，活最佳）的作用下，以NTP为料，从引物′端开始以从′→3端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链每一循环经过变性、退火和延伸含即加一倍。如图所示：现在有些CR因扩增区很短，即使酶性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃℃间进行，减少一次升降温过程，提高了反应速度。检PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧素（溴化乙锭EB染色凝胶电泳是最常用的检测手段泳法检测特异性是不太高的此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判但为简捷易行成为了主流检测方法近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。2.2反应系10扩增缓冲液μldNTP混合物（终浓度）各100μmol/L引物（终浓度）各5～μmol/L模板0.1～μTaq聚合酶510U（浓度）1～补加双蒸水100μl其中dNTP、引物、模DNATaq聚酶以及的加量（或浓度）可根据实验调整。RT-PCR：RT-PCR为转录（reversePCR）实时（realPCR）同的缩写。逆转录，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)是聚合酶链式反应PCR)的一种广泛应用的变形。在中一条RNA链被逆转录成为互补，再第6页

以此为模板通过PCR进行DNA扩。3.1RT-PCR技术关剂oligo:多聚体，相当于引AMV：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLVRT莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶脱氧核苷酸RNaseRNA水酶PCRBuffer缓液MgCl22价离子2.2操作骤辑反原理总RNA提取：见相关内容。cDNA第链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例：（1在0.5ml微离心管中，加入总μ，充适量的DEPCH2O使体积达11μl在管中加μMOligo）12-18μl，轻轻混匀离心。（2℃加热，立即将微量离心管插入冰浴中至少。然后加入下列试剂的混合物：10PCRbuffer2l25mMMgCl22l10mM1l0.1MDTTμl轻轻混匀，离心42孵育。（3加入SuperscriptⅡμl，42水浴中孵育。（4于℃加热15min以止反应。（5将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37孵育20min，降解残留的RNA-20℃保存备用。2.2.3．：（1取0.5ml管依次加入下试剂：第一链cDNAμl上游引物（μl下游引物（μl4l10PCRbuffer5lTaq酶（μl）μl（2加入适量的，使总体积达50l。轻轻混匀，离心。（3设定程。在适当的温度参数下扩增个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在扩目的基因时，加入一对内参（如G3PD的特异性引物，同时扩增内参DNA作为对照。（4电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察结果。（5密度扫描、结果分析：采用凝胶图像析系统，对电泳条带进行密度扫描。第7页

2.3注事．在验程中要防止RNA的解，保持的整性。在总RNA的取过程中，注意避免mRNA的裂。2.3.2．为了止非特异性扩增，必须设阴性对照。．内的定主要为了用于靶RNA的量常的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶（β肌动蛋白）等。其目的在于避NA量误差、加样误差以及各CR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。2.3.4．PCR不进入平台期出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标起的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。2.3.5．防止DNA的染：（1采用酶理RNA样品。（2在可能的情况下，将PCR引置于基的不同外显子，以消除基因和RNA共线性。泳聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定聚烯酰胺凝胶电泳时具有电荷效应和分子筛效应以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开且可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开分率远远高于一般层析方法和电泳方法以检出10-910-12g的品，且重复性好没有电渗作.SDS聚烯胺凝胶电泳可测定蛋白质分子.其原理是带大量电荷的SDS结到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的/比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极（1～μ只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质些蛋白质不易与SDS结如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描而出定量的结果凝胶扫描仪主要用于对样单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度析蛋白质混合物的组分；③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。3.1琼糖胶泳原理琼糖是从海藻提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中后形成一种固体基质其度取决于琼脂糖的浓度。将凝胶置电场中，在中性pH值带电荷的核酸通过凝网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为至50kb。3.1.2琼糖凝胶电泳的仪器及试剂仪设备应包括水平凝胶电泳槽及其配电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。第8页

试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。电泳缓冲液常用中5.4g硼，mol/L，pH8.0)。溴化乙锭ethidium，EB)是一种荧光染料，它可以嵌入核双链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移凝胶置紫外光下，插入核酸链中的B在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移EB见易分解，应存棕色试剂瓶中于℃下保存。由于EB是种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。常用的凝胶加样缓冲液有4种见表：表1凝加样缓冲液缓冲液类型Ⅰ

×缓冲液溴酚蓝二苯青40%（W/V蔗糖水溶液

贮存温度4Ⅱ

溴酚蓝二苯青15%（W/V）聚蔗糖水溶液室温ⅢⅣ

溴酚蓝二苯青30%（W/V甘油水溶液（W/V）糖水溶

443.1.3凝的制备和电泳操作方法如下：用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的塑料盘的边缘圈封胶水工台上；称取适量琼脂糖，置电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；待溶液冷至60，加入贮液，使终浓度达；在距离胶模底板处置电泳梳将脂糖溶液倒入胶模中厚约注意避免产生气泡；凝胶完全凝固后，移去梳子和透明胶，将凝胶放入电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好没过胶面约1mm将样与积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；接通电源，使样品槽在负极端，用的压，电适当时间；电泳结束后，可将含EB凝胶直接放在紫外线检测仪上观察，并拍照记录，也可将不含EB的胶在μg/ml的EB溶液中染色分钟，再如上观察和拍照，记录结果。凝摄影需配置135照机全色胶照机固定架近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。操作需在暗室进行将机固定把胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。溶的净化处理由于具一定的毒性，实验结束后，应对含EB的液进行净化理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。对于含大于0.5μg/ml的溶液，如下处理：①将溶用水稀释至浓度低于0.5μ；②加入一倍体积的KMnO4，匀，再加入等量的25mol/LHCl，匀，置室温数小时；③加入一倍体积的NaOH混匀并废弃。含小于μg/ml的液如下处理：①按1mg/ml的加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；②用纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。第9页

切接4.1实方法原理制内酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链。4.2实材料：标准pUC192686bp）试剂、试剂盒：EcoRI及配套的酶切缓冲液0.5电缓冲液6×Loading琼脂糖仪器、耗材：水平电泳仪水锅移器波炉成像设备4.3实步骤在的心管中，按照下表加入试剂（单位ul匀点动离心将反应液甩至管底。℃保温2h进酶切反应。反结束后，加入2ul×Buffer化酶活性：℃，保20min使失活电检测。酶切阴性对照：标样×LoadingBuffer酶切样品：标准pUC19酶样品10×LoadingBuffer2ul4.4注事项影响酶切的因素：在酶切反应中DNA的度、缓冲液中的离子强度等素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切。受细感受态细（competent方法诱导细胞使其处于最适摄取和容纳外来的理状态。制作：5.1CaCl2法（）（已先准备好）新活化的DH5α菌平板上挑取单个DH5α大菌落（超净工作台操作种于～5ml液培中℃振荡210-240r/min）培养左右，直至对数生长期。将该菌悬液以：～1转于LB液培养基中℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔～测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养（培养～至OD6000.5左）（2）无菌条下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚烯管（Falcon）中，在冰上放置，培养物冷却至℃切记：下述所有步骤需无菌操作(在超净工作台完成。。于℃转分离心10分，以回收细胞。（3倒净上清培养液，将管倒置分以使最后残的痕量培养液流尽。用冰的0.1MCaCl2溶轻悬浮细胞，冰浴30min～4，4000r/min心10min；（4弃去上清液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽，加入冰的0.1MCaCl2溶，心悬浮细胞。冰浴，0～℃4000r/min离10min（5弃去清液每50ml初培物用2ml用预冷的0.1MCaCl2心重悬每份细胞沉淀冰放置片刻后即制成了受态细胞悬液备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积％左右高压灭菌过的甘油，轻柔混匀后在超净工作台将细胞分成每份μL的份，液氮速冻后，置-70条件下，可保存半年至一年果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转-70℃冰箱保存第10页

5.2转从-℃冰箱中取200μl感态细胞液，置于冰上使其解冻，解冻后立即置冰上。加含质粒溶入半的连接产物DNA溶混的一半置-20冰箱保存。含量不超过50ng,积不超过μl轻匀，冰上放置30钟。同时做两个对照：对照组：以同体积的无菌双蒸水代替液,它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的板上应没有菌落出现。对照组2同积的无菌双蒸水代替DNA溶但涂板时只取μl菌涂布于不含抗生素的LB平上,此组正常情况下应产生大量菌落℃水浴中热击秒或37水浴钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分。向中加入1ml体培养(不含Amp),混匀后37振荡培养1小,细菌恢复正常生长状态,表达质粒编码的抗生素抗性基(。将述菌液摇匀后取μl涂于含Amp的选平板上面上放置半小时菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿℃培养16-24小计转化率，统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每粒）＝转化子总数／质粒DNA加(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数5.3筛和定利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。5.3.1器旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。5.3.2试培养基（加抗菌素PCR用试剂，引物，质粒提取用试，酶切需要的限制性内切酶及其缓冲液65%油（65%油MgSO4，实验准备无菌1.5mL离心管装入铝制饭（灭菌器吸头装入相应的吸头（灭菌牙签（灭菌菌管（灭菌100mg/mL苄青霉素。5.3.3操步骤方法一：酶切鉴定（1在超净工作台中取支无菌菌管，各加入（50mg/mL苄青霉素记号笔写好编号。（2在超净工作台中将70%醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL（含氨青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个菌管中。（3℃摇菌过夜后用碱裂解法分别提取质粒菌管中的剩余菌液保留在冰箱中。（4将提取到的管粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选取有插入片段的第11页

粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。（5将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL液与500mL甘油混合后-℃保存。（6在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。方法二：快速PCR筛法（1在转化的平板培养基上随机选取个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。（2在0.2mL微离心管中配制25μL反体系。waterμL×buffer不含MgCl2）2.5LmMMgCl2μL2.5dNTPμL每种dNTP终浓度0.2mM）μmol/LPrimer11μL）mol/Lprimer2μL（pmolesTaq酶0.5μL）总体积μL模板质粒：用小tip头轻粘一下选中的白色菌落，伸入混液中洗一洗（3根据厂商的操作手册设置的循环程序（本实验室已经设置为WZ①℃②94℃③℃1min④℃1⑤②29times⑥℃10min（4）PCR结束后，取10L产进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对胶上是否有预计的主要产物带。（5按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒（6提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。第12页

二、干扰技术

（房蕾）1.siRNA的设计1.1在计实时，可以先、进行目标序列的筛选：目序列的选取原则：从转录本（mRNA的AUG始密码开始，寻找AA二连序列，并记下其3'端的个碱基序列潜在的siRNA靶点究果显示GC含量在—左右的siRNA要比那些量偏高的更为有效。等建议在设计siRNA时要针对5'和端的非编码区（untranslated，UTRs)原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些结蛋白或者翻译起始复物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从影响siRNA的果。将在序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/同的序列。例使用BLAST选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的序。阴对照一个完整的siRNA实应该有阴性对照为性对照的应该和选中的序有相同的组成是mRNA有明显的同源性常的做法是将选中的序打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。siRNA制目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经III类解E.coli,III)外制备siRNA，以及通过siRNA表载体或者病毒载体，PCR备的表框在细胞中表达生。2.1体制化合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA主要的缺点包括价格高，定制周期长是特殊需求的价格比其他方法高个因合成3siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的的情况下，要大量siRNA进研究不用于：筛选siRNA等时的研究，主要原因是价格因素体转录以DNAOligo为版，通过体外转录合成，本相对化学合成而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小定性好率高需化学合成的量就以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。最适用于：筛选，特别是需要制备多种siRNAs化学合成的价格成为障碍时。第13页

不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA长期研究。用III消化长片断双链制siRNA其他制备siRNA的法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序以便找到一个有效的siRNA而用这种方法——制备一份混合有各种“合鸡尾酒”就以避免这个缺陷。选择通常是—1000碱基的靶模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，后用IIIDicer)在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒掉没有被消化的dsRNA后这个混合物就可以直接转染细胞方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金（意通用III通比用Dicer要宜这方法的缺点也很明显就有可能引发非特异的因沉默别是同源或者是密切相关的基因现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定s进研究，特别是基因治疗。2.1.4体表达前面的方法主要都是体外制备siRNAs并且需要专门的RNA转试将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA达载体和基于PCR表达框架则属于：从转染到细胞的版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。2.2达体多数的表载体依赖三种RNA聚酶III启子polIII)中一种纵段小的发夹RNA(shortRNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启子人启动子之所以采用RNAIII动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA而且它是通过添加一串到个U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段码短发夹RNA序的单，退火，克隆到相应载体的III启子下游。由于涉到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的siRNA序，需要维持较长时间的基因沉默。不适用于选序其主要是指需多个克隆和测序等较为费时琐工作2.3siRNA表达架siRNA表达框(siRNAexpressioncassettes，SECs)一种由到的表达模版，包括一个RNAIII动子，一段发夹结构siRNA，一个polIII终位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和表载体不同的是不要体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由CR得，不用一天的时间。因此SECs成为筛选的有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和s的最适搭配。如果在两端添加酶切位点，那么通过筛选出的最有效的后可以直接克隆到载体中构建siRNA表载体。构建好的载体可以用于稳定表达长效抑制的研究。第14页

siRNA转3.1将备好的siRNAsiRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要以下几种：磷钙共沉淀将氯化钙RNA(或和磷酸缓冲液混合沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸-DNA复物粘附到细胞膜并通过胞进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要验中使用的每种试剂都必须小心校准质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都导致磷酸钙转染的失败。电孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异认这电压差异会导致细胞膜暂时穿孔脉和场强的优化对于成功的转染非常重要过的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平或更高）的毒性DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚或polybrene多体复合物和带负电的分使得DNA可结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复体导入。两种试剂都已成功用于转染DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转。机法转染技术也包括使用机械的方法如显微注射和基因（particle注射使用一根细针头将RNA或白直接转入细胞质或细胞核因使用高压将大分子导入细胞。阳子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时以成微小平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的酸骨架上以及带负电的细胞膜表面此用阳离子脂体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同用阳离子脂质体试剂并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自结合到带正电的脂质体上，形成阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就被导入培养细胞。现存对转原理的证据来源于内吞体和溶酶体。3.2为达到高的转染效率，转染实验过程中，需要注意以下几点：纯siRNA在转染前要确认siRNA的小和纯度。为得到高纯度的siRNA推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通需要跑胶电泳纯化（即胶化避RNA酶染微量的RNA酶导致siRNA实失败由实验环境中RNA酶普遍存在如皮肤头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受R酶染非常重要。健的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用代下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。避使用抗生素Ambion公推荐从细胞种植到转染后72小期避使用抗生素素会在穿透的细胞第15页

中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。选合适的转染试剂针对siRNA备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对实验的成功至关重要。通合适的阳性对照优化转染和检测条件对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转靶细胞（同样适合实验靶siRNA染48小后计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将致胞毒性以至死亡。通标记siRNA来化实验荧光标记的siRNA能来分析siRNA稳性和转染效率。标记的还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。最近在等哺乳动物细胞内展的大规模筛（large-scaleRNA）工作在学术界引起了广泛的关注。在过去短短1年，规模筛技术已经得到了广泛应用例将应用于研究体外培养人体细胞的分裂过程应用于鉴定HIV病毒感染需要哪些宿主因子于寻找哪些基因对于人类细胞是必需的以及应用于找出与综合症5（5q-syndrome致病相关的基因等方面。第16页

三、启动分析和转录子分析1启子析

（王芳琴1.1、对于要分析的基因，我们需要搞楚它的一些基本信息，第一步借助NCBI上的Genbank查目的基因5端游序列，在此以SEPT4/ARTS基为例。首先我们进入Genbank界面（/genbank/）searchSEPT4/ARTS搜索结果中第一个就是我们要的Homosapiens目基因以己根据研究内容进行选择点击进入就可以看到该基因非常详细的信息：可以找到该基因在染色体上的定位Location:17q22近年关研文Relatedarticlesin及它码四mRNA和白我要的相的序列，击图的Genbank第17页

找到相应的join(8737..8858,13841..14137,14506..14599,15038..15124)及CDSjoin(8856..8858,13841..14137,14506..14599,15038..15124,...)在面对应的序列中就可找到起始密码子ATG为了不遗漏启动子序列选择ATG上3000bp和游1000bp的列进行分析也可以根据自己的情况决定。后面将用UCSC和查相应目的基因片段1.2、接下来是UCSC(目的基因的定位，点击Genomes输入目的基因后点submit点击Tables,进下图第18页

点击getoutput跳出对话框中击submit点击进入结果如下图第19页

对应相应的序列发现，搜索的结果和NCBI给出的是完全一致的1.3、对于DBTSS（http://dbtss.hgc.jp/）结果结果中给出了TSS位启动子序列中可能含有CPG岛至第一步寻找目的基因片段的任务圆满完成。第20页

还有一种寻找启动子的新方法上面介绍的更加直接简而且准确率那是相当之高，无论你想找什么基因的启动子，这里统统都可以实现。打开下面这步：点击Sourcesequence(s)找对自己的基因信息第21页

点击圈圈里的东东。第22页

结果第23页

对于基因启动子可以用第二种法进行查找根据启动子的定义本着不漏过错过的原则，可以选择基因翻译起始位点ATG上游4000bp下1000bp共5000bp的基片段进行分析。综合多篇相关文献提供的启动子分析软件，可以用到FirstEF（/tools/FirstEF/PromoterScan(/molbio/proscan/)、DrosophilaGenomeProject（/seq_tools/promoter.htmlsoftberry-fprom(/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)及promoterInspector进分析。在第二部中将会用到FIRSTEF/PromoterInspector/promoterscan/NeuralNetworkPromoterPrediction/softberry等软件对目的基因片段行启动子分析；用CPGPlot、CPGFinder对目的基因可能含有的CPG岛行分析TFSearch/TESS/SOftberry对可能含有的转录因子进行分.2与动结的录子析2.1预Transcriptionbindingsite2.1.1用Jaspar/2.1.2用PROMOhttp://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_用TFSEARCH据说用的是TRANSFAC很的数据库）http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html2.1.4用业数据库TRANSFAC（付费）/pub/databases.html/2.2.1/点JASPARCOREvetebrata左边转录因子选择MA0061.1NF-kappaB，右边输入ANKH启动子区域，点击SCAN结果得到5个Transcriptionfactorbinding，其Strand-1有特殊意义，另外三个GGGAAATACC得分最高第24页

2.2.2http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3Step1selectspecies选择humanStep1SelectFactors择NF-kappaB[T00590]Step2SearchSites输ANKH的promoter域结果中有一个位点，JASPAR结果中得分最高的相2.2.3http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.htmlEnteralabelforsequence:输入基因名字ANKHEnteryourDNAsequence输入ANKH的promoter区点击submit结果中有2个NF-kap位，中正义链，JASPAR结中得分最高的相同。第25页

分析上边的各种元件，如各种BOX什么，各种类型的转录因子都有自己的序列倾向性，可查找到相关的转录因子，然后再做验证。2.3启子结及启子DNA合白研策2.3.1启子是一段位于结构基因5游区的DNA序，能活化合酶，使之与模板DNA准地结合，并具有转录起始的特异.基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物.启动子分三:启子Ⅰ、启动子Ⅱ、启动子.只有启动子Ⅱ指导mRNA的录真生物启动子Ⅱ由两大分组:上元件upstream和动子核心(corepromoter).上元与转录的效率有关;启子核心包括部:TATA、起始子及下游元件downstreamelement).盒转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区与录起始位点精确选择及转录有关始子是转录起始所必须下游元件作用尚不清楚.原核生物启动子区范围较小，包括TATAAT区(Pribnow区及其上游TTGACA区基因转录实际上是聚酶，转录调因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果启子DNA结蛋白作为转录调控因子通与启动子DNA结以调节基因转录.犹如抗原抗体特异性结合一样，蛋白质与DNA的合也是特异的，这是研究启动子结蛋白的前提.对启动子结蛋白的研究方法可分为大，第类细胞内方法，以已知启动子DNA序筛选出与其相结合的蛋白编码基因，通过生物信息分析来定该蛋白质的名称，由于是细胞内筛选，因此更符合生理状态，且操作简便，适合大通量筛选，用于寻找未知基因及蛋白.不之处有二，一是只能筛选可与启动子DNA特异性结合的蛋白质如为筛选蛋白质这已足够)，但不能检查出精确的蛋白结合位.二特异性有时略差这方法包括酵母单杂交技术，噬菌体表面展示技术.第二类是细胞外法，即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合该法特异性好，且能够在启动子DNA序列上到精确的蛋白质结合位点但这种方法效率低作复杂一不用于寻找未知基因及蛋白质，这类方法包括凝胶阻滞试(gelretardationassay)DNase足迹试(ⅠFoot-printingassay等研者可根据研究目的选用其中一种或二者结合达到既找到未知基因及蛋白质，又能够找到该蛋白质的精确的结合位点及证实二者结合的特异性。2.3.2研究方法酵母杂技酵母单杂技术是1993由etal。从酵母双杂交技术发展而来的本原理:真生物基因的转录起始需转录因子参与因通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成DNA结结构域DNA-bindingdomain，和转录激活结构域activationdomain,AD).用酵母单杂交系统的酵母GAL4白是一种典型的转录因子，的DNA结结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚酶或转录因子TFIID相作用，提高聚合酶的活.在一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作.据，我们可将的DNA结结构域置换为文库蛋白编码基因要其表达的蛋白能与目的基因相互作用样通过转录激活结构域激活RNA合酶，启动下游报告基因的转.其本操作过程:(1)计含目的基因称为诱和下游报告基因的质粒并将其转入酵母;将文库蛋白的编码基因片段与转激活域融合表达的cDNA库质粒转化入同一酵母;若文库蛋白与目的基因相互作用通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出.在里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动基因结合蛋.酵单杂交技术广泛用于DNA蛋白相互作用的研究，洪源etal应用该技术成功筛选出乙型肝炎病毒表面抗原启动子SPⅠ的合蛋白。第26页

噬菌展技噬菌体属于单链DNA病[，长000bp，因组编码11蛋白质，其中种结构蛋白，与噬菌体展示技术相关的是结构蛋白pⅢ和pⅧpⅧ前体由73个基酸残基组成，其中信号肽为23个基，根据构外壳的功能可分四个区，6-24氨酸残基区域占据噬菌体表面的大部25-35氨酸残基区域具有高度疏水性，C端DNA相合，构成完整的内壁N端可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位.pⅢ前体由424个基酸残基组成，位于噬菌体的尾部，由四个功能区组成，即信号肽区、受体结合区C端疏水区及穿膜区，穿膜区是最外露的区域，是插入外源基因的最佳位置.噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择结合的技术本原理及操作过程为:以改构的噬菌体为载体待基因片段定向插入噬体外壳蛋白基因区如噬菌p和pⅧ衣壳蛋白基因区N端入源基因形成的融合蛋白表达在噬菌的表面不响噬菌体的生活期及天然构型易被相应的抗体或受体分子识别源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面固定或固相支持物结合通过适当的淘洗洗去非特异性结合的噬菌体(即亲和富集法)，选出目的噬菌体，而编码基因为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测得知.在这一过程中基是编码启动子DNA结蛋白的文库基因，而固定或固相支持物分子则为启动子片段.噬菌体展示技术是一种经济高效的研究生物大分子相互作用的技术建菌体随机多肽文库可用来筛选包括抗体、小分子、细胞表面受体等多种分.。etal噬菌体展示技术筛选出肝富有的转录因子HNF1a启动子结合蛋白。DNA迁移变试DNA迁率变动试(DNAmobilityshiftassay)叫凝胶滞试验，是一种体外研究DNA与白质相互作用的特殊的凝胶电泳技.基原理为:在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片比其结合了蛋白质的DNA片向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片，将其蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA合蛋白。将该验改进DNA与多的蛋白结合，移动速度进一步减慢，这种方法又称超级迁移率变动试(supershiftassay).由其特异性好DNA迁移率变动试验常用来鉴定其他方法筛选出的结果。显而易见，克隆启动子NA片并标记实就可找到相应的结合蛋.Garuti用该试验证实肝细胞核因子3a(HNF3a)能与乙型肝炎病毒核心启动子特异性结合。2..3.2.4Ⅰ迹验足试验不仅能找到与特异性DNA结的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，足迹试验的方法较多，常用的有DNaseⅠ迹试验、硫酸二甲酯足迹试验dimethylsulfate，者原理基本相.Ⅰ迹试验的原理为蛋白结合在DNA片上，保结合部位不被DNase破，这样，蛋白质在DNA片段上留下了足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带技流程为15]:(1)检双链DNA分用P32作端标记只记一端(2)蛋白质与DNA混等二者结合后，加入适量的DNaseⅠ，消化DNA子控制酶的用量，使之达到每个DNA子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的对;(3)DNA上去蛋白质变的DNA加在测序凝胶中作电泳和放射性自显影对组相比后解读出足迹部位的核苷酸序.足迹试验特异性好位精确用广[20,21].Raneyet应Ⅰ足迹试验确定转录子Sp1在HBV表抗原启动子的结合位点-49～-29核苷酸序列之间。3转因表量测3.1可找文献看基因B高达的肿瘤组织中那些转录子高表达了。3.2可过westernblot法分析转录因子的表达量。第27页

分别选取该组织正常细胞和基因B高达细胞做westernblot3.2.1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)可以使用适当的裂解液例碧天生产的Western及IP细裂解(P0013)裂解液等裂解贴壁细胞、悬浮细胞组织样品于些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白细浆蛋白线体蛋白可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度根所使用的裂解液的不要采用适当的蛋白浓度测定方法为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大使碧云天生产的Western及细裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋浓度测定试剂盒(P0010P0010S/P0011P0012P0012S)。3.2.2.电泳Electrophoresis)(1)SDS凝配制SDS凝可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的凝胶配制试剂盒(试盒提供了除和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS的方。(2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋上样缓冲液。例如2X或5X的SDS蛋上样缓冲液。使用的SDS蛋上样缓冲液可以减小样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品5XSDS白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制以用碧云天生产的SDS蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。100或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3)上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到胶样内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS电液(/P0014B。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的准电泳装置或类似电泳装，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左。SDS可采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪带定时。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS过恒压的方式，通常把电压设置在100V然后设定定时时间为90－分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3.2.3.转Transfer)我们推荐在Western实中选用PVDF膜(。酸纤维素膜(NC膜也以使用硝酸纤维素膜比较脆操过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的准式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，膜时间为30-60分。也可以在15-20mA转过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜第28页

槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色(P0022)膜进行染色，以观察实际的转膜效果也以用考马斯亮蓝快速染色(P0017)对完成转的SDS胶进行染色以观察蛋白的残留情况。3.2.4.封Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的W洗液中漂洗1-2钟洗膜上的转膜液转完毕后所有的步骤定注意膜的保湿免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空(或管等吸尽洗涤液加入Western封液，摇床上缓慢摇,温封闭60分。对于一些背景较高的抗体，可以℃闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇(或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。3.2.5.一孵育Primaryantibodyincubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用一稀释液(P0023A)释一抗。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液即入稀释好的一抗室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可4缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。回收一抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分。共洗涤3次如果结背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。注Western结果通需要提供内参作为对照可以选用体(或Actin抗体AA128)进行内参检测。3.2.6.二孵育Secondaryantibodyinucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用二稀释液(稀辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG则二抗需选择抗小鼠IgG的抗如辣根过氧化物酶标山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)碧云天有多种二抗提供。用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液即入稀释好的二抗室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤分。共洗涤3次如果结背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。3.2.7.蛋检测Detectionofproteins)参考相关说明书用Plus(P0018)等ECL试剂来检测蛋白片以采用专用的压片暗进。洗片时可以使用光自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0020)自行配制显影液和定影液行手工洗片光推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMATBT胶(。4.与转因结的活抑因检4.1酵双杂交系统的原理酵母的转录激活因子由个以分开的、功能上相互独立的结构(domain)成N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合(DNAbinding端一由113第29页

个氨基酸组成的转录激活(transcriptionactivationdomain,AD)。BD可和上游激活列(upstreamactivatingsequenceUAS)合，而AD则激活UAS下的基因进行录。但是单的BD或AD不激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用对白质之间微弱的瞬的作用也能够通过报告基因敏感地检测到母杂交技术不仅应用于哺乳动物蛋白质之间的相互作用研究以用来研究高等植物蛋白质之间的相互作用。4.2酵双杂交系统的组成：载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA库酵母菌株：EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的侣菌)大肠杆菌菌株：E.coliKC8对照：pLexA-53，pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4AD融蛋白〕阳对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少其它蛋白相互作)假阳性检测质粒引物：pLexA测引及pB42AD测引物。4.3酵双杂交系统的实验步骤：4.3.1.将告基因p8op-LacZ转酵母菌株，用培养基筛。4.3.2.同构建DNA库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。4.3.3.构靶蛋白质粒，为钓饵(。4.3.4将上述钓饵质粒pLexA-X转EGY48(p8op-LacZ)胞株，用SD/-His/-Ura筛;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检此DNA-BD/蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。4.4转质粒选培养基克生长情况说(含有pLexA-PosSD/-His-Ura蓝阳对照pLexASD/-His-Ura白阴对照PlexA-XSD/-His，-Ura白没直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura蓝具直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌不生长酵母胞毒性能够自动激活报告基因设去除其激活活性部位将LacZ报告基因整合入基因组，4.4.1.如pLexA-X半乳糖苷酶的信号作用减少。4.4.2如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细有毒性，则需要与纯化的文库DNA同转化酵母。4.4.3如pLexA-X不自动激活报告基因也不具有毒性可以在纯化的文库DNA同、顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。转化质粒SD固培养基LacZ型对照pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura蓝对照pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu蓝+pB42AD-T实验pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待第30页

+pB42AD-文库4,.5.1.用SD/-His/-Trp/-Ura培基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。4.5.2.上重组子转至含X-gal的体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu观察LacZLeu告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说Leu有表达，但b-半乳糖苷无表达。4.5.3.同用LacZLeu两报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如AD融蛋白不与目标蛋白结，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。4.5.4.将色阳性克隆进行1以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。4.6.阳克隆的筛选4.6.1.随选取50个性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。4.6.2.如重复的插入序列较多，可另取50个性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。4.7.用粒自然分选法(NaturalSegregation)筛除只含有AD-库杂合子的克隆4.7.1.将步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液培养基培1-2天含HIS3编序列的BD-靶质粒在含有外源His养基中，将以10%-20%左右的频率随丢失。4.7.2.将述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，C孵2-3天。4.7.3.再取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培基中，筛选表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。4.7.4.将His表型缺陷的克转化固体诱导培养基，以验证AD-库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。4.8.酵杂合试验(YeastMating)确定真阳性克隆如下表所示，在酵母及对应的YM4271宿细胞中分别转入相应的质粒或文库，通过杂合实验筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-库确实具有相互作用的真阳性克隆。质粒(inYM4271)质粒2(inEGY48)LacZ表Leu表pLexA白不能长pLexA-DNA白不生长pLexApB42AD-库白不能生长pLexA-DNApB42AD-库蓝真阳性pLexA-LampB42AD-库不能长4.9.阳克隆的进一步筛和确证4.9.1.扩初步确定的阳性克隆，提取酵母DNA。它既含有母基因组，也含有3种转化的质粒。4.9.2.将述DNA电转化E.coliKC8由于在肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容同利用营养缺陷型筛选。因此，M9/SD/-Trp培基上，只有含有A文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并提取质粒DNA，切鉴定。4.9.3.用pLexA-靶DNA与pB42AD-DNA一对应、转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中先到SD/-His/-Trp/-Ura板增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZLeu报告基的表达。第31页

4.9.4.扩与靶DNA互作用的文库，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。4.10.对双杂交系统阳性结果的进一步研究4.10.1.用同的双杂交系统验证.将体pLexA与互后行双杂交实验。.选不同的双杂交系统，如：以GAL4录激活子为基础的双杂交系统。.将库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活.去或突变特定结合位点，定量检测b-半糖苷酶水平，比较作用强度变化。4.10.2.用剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序，证明其编码区域。4.10.3.用它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法