药品质量研究与质量标准-有关物质检查常见问题讨论-余立课件

药品质量研究与质量标准

-有关物质检查常见问题讨论

第一次飞跃第二次飞跃纯度控制杂质控制杂质谱控制杂质质控理念的变迁杂质（Impurity）的定义与分类任何影响药品纯度的物质均称为杂质。-《中国药典》2010年版附录对药品杂质的定义原料药中：化学结构和该药品不一样的任何物质制剂中：除原料药和辅料外的任何其他成分-

ICH对杂质的定义杂质按来源分类杂质有关物质

（relatedsubstances）无关杂质

外源物质

杂质来源1

有关物质－起始原料－中间体、副产物异构体和聚合物多晶型－降解产物异构体和聚合物多晶型－微生物－污染异物－非法添加物3

外源物质2无关杂质－试剂配位体、无机盐、溶剂－重金属催化剂－过滤介质、活性炭已鉴定杂质IdentifiedImpurity特定杂质SpecifiedImpurity潜在杂质PotentialImpurity杂质谱ImpurityProfile已确证了结构特征的杂质在质量标准中规定检查并有自己限度标准的杂质。已鉴定或未鉴定理论推测在生产或贮藏过程中可能产生的杂质实际产品中不一定存在存在于药品中的所有杂质组成或模式1.原料：红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素D、红霉素E、红霉素F、阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F2.中间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、红霉素A肟（E）、红霉素C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺3.副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇霉素、阿奇霉素N-氧化物、3’-去（二甲氨基）-3’,4’-去氢阿奇霉素、O-甲苯磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、N，N-去二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3’-N，N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯4.降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、红霉素8，

9-脱水-6，9-半缩酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮阿奇霉素中可能存在的杂质：37种附录ⅩⅨF药品杂质分析指导原则附录ⅩⅨA药品质量标准分析方法验证指导原则2010年版

药典中的杂质分析Q3A－新原料药中的杂质Q3B－新制剂中的杂质ICH中的杂质分析有关物质检查的常用方法适用多种杂质（定性＋定量）主要用于没有紫外吸收的杂质（定性＋半定量）适用不同的特定杂质（定性＋定量）TLCHPLC其他方法有关物质检查的其他方法容量滴定原子吸收重量法比色比浊物理常数紫外其他方法物理常数测定法

旋光度-检查具有光学活性的杂质紫外分光光度法

杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质容量滴定法

游离脂肪酸、过氧化物、还原糖重量法

酸中不溶物、水中可溶物比色比浊法

游离淀粉、碘化物、铁盐等；氯化物、硫酸盐

有关物质检查的其他方法有关物质检查的其他方法HPLC方法的建立与验证高效液相色谱法系用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。二极管阵列蒸发光散射示差折光电化学质谱荧光紫外检测器的种类HPLC方法的建立溶液浓度

流动相

检测波长

色谱柱

系统适应性试验方法进样体积

柱温

溶剂

典型的HPLC方法测定有关物质有关物质照高效液相色谱法（附录ⅤD）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（pH6.3）［取磷酸二氢钾9.07g，加水1000ml使溶解，用无水磷酸氢二钠溶液（9.46g→1000ml）调节pH值至6.3，临用前稀释10倍］-乙腈-甲醇（36：11：3）为流动相，流速每分钟1.5ml；检测波长为200nm；柱温40℃。分别取前列地尔对照品溶液、前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品溶液各适量，按（1：1：1）比例混合，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。取该溶液25μl注入液相色谱仪，调节色谱系统，使前列地尔峰的保留时间约为11～13分钟，前列腺素A1峰与前列腺素B1峰的分离度应符合要求；同时调节检测灵敏度，使前列腺素B1峰的高度约为满量程的10%。

测定法

精密称取本品适量，用乙腈-水（9：1）溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液；精密量取含量测定项下的对照品溶液适量，用乙腈-水（9：1）稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为前列地尔对照品溶液；另精密称取前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品各适量，用乙腈-水（9：1）分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含15μg和5μg的溶液作为前列腺素A1和前列腺素B1的杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、前列腺素A1、前列腺素B1杂质对照品溶液和前列地尔对照品溶液各25μl,分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液的色谱图至主成分峰保留时间的4倍。前列腺素A1和前列腺素B1均按外标法计算，分别不得过1.5%和0.5%；其他杂质按主成分自身对照法计算，单个最大杂质的峰面积不得过前列地尔对照品溶液的主峰面积（1.0%）；杂质总量不得过2.0%（小于0.01%的色谱峰不计）。

HPLC方法的建立与验证溶剂的选择：溶液稳定性考察-溶解度高且稳定＞8小时不需提示＜4小时提示临用现配或立即进样＜2小时改换溶剂-无背景干扰或小

溶剂峰、倒峰

-低毒价廉检测波长的选择

主波长、低波长、杂质波长、权衡波长

检出杂质的数与量干扰因素操作的便捷性

检测波长的选择流动相的选择-分离能力强

（各种有关物质基本分离）-温和稳定（pH、比例适中对柱伤害小，性质稳定）-配制简单、易得价廉-无毒环保头孢曲松钠的流动相原来0.8%四庚基溴化铵乙腈溶液-水-磷酸盐缓冲液-枸橼酸缓冲液（500：440：55：5），由4种成分组成，需配制3种缓冲液；后改为0.02mol/L正辛胺溶液-乙腈（73：27），用磷酸调节pH值为6.5，仅由2种成分组成

流动相的选择分离能力的考察-粗产品溶液或配制各种杂质混合物

（起始原料，中间体，副产物）

-强制降解（酸、碱、光、热、氧化）二、HPLC方法的建立与验证强制降解的考察方法误区：（酸、碱、光、热、氧化）

-破坏条件过于强烈（控制在主成分降低10%~20%为宜）-中和方法-目的不明确，结论不正确分离能力的考察二、HPLC方法的建立与验证-不规定柱温（不需加温且对温度不敏感）-25℃或30℃

（不需加温但对温度敏感，需保持恒温）-35℃～70℃（需加温且对温度敏感，需保持恒温）作为耐用性试验之一且可与溶液稳定性同时进行柱温的确定溶液的配制需要注意的几点：-需否避光？-可否超声、加热、多久？过滤？滤材？

-浓度与线性范围和检测限是否匹配？弃20ml初滤液？用xx膜过滤？用聚四氟酰胺小瓶？机械振摇xx分钟等等？二、HPLC方法的建立与验证-常用10μl～100μl-过低误差大，影响重现性-太多过载，影响峰形与分离

-配合溶液浓度保证检测灵敏度进样体积的确定色谱系统的适用性试验-指标的应用-分离度的保证-灵敏度的测试

-精密度的要求CompanyLogo系统适用性试验要求重复性理论板数分离度保留时间拖尾因子常用指标

分离度指标性物质的选择

-难分离物质对-最常出现的杂质-单独规定限度的特定杂质

-结构性质相近且不干扰测定的物质二、HPLC方法的建立与验证-准确定量分析时通常两峰间R≥1.5-峰高峰谷比

分离度的要求

拖尾因子（T）的要求与应用为保证分离效果和测量精度用于评价色谱峰对称性的指标T=W0.05h/2d1式中W0.05h

为5％峰高处的峰宽；d1为5％峰高出峰顶点至峰前沿之间的距离除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05

之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。峰前峰后有紧邻杂质峰时，对拖尾因子作出规定。

重复性（RSD）的要求

用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3

种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%在质量标准中如果没有明确规定，就是≤2.0%CompanyLogo特定杂质峰定位的方法

杂质对照品混合对照品临时降解相对保留时间+参考图峰定位方法的验证验证定量限度-准确度+--精密度+-

重复性+-中间精密度（+）

--专属性++-检测限（+）

+-定量限+

-

-线性范围+-

-耐用性++CompanyLogo

杂质含量的计算对照品外标法主成分自身对照法加校正因子的自身对照法面积归一化法对照品外标法优点缺点50%定位方便定量准确要求严费用高70%有条件时首选的方法主成分自身对照法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%没条件时首选的方法加校正因子的主成分自身对照法优点缺点50%定位方便定量较准确需测定因子定位难70%杂质与主成分响应因子差异大（超过0.9~1.1）且对照品昂贵时选用的方法面积归一化法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%不提倡使用的方法影响多重复性差CompanyLogo特定杂质

非特定杂质有效杂质宽管毒性杂质严控杂质限度的规定单个不得过0.10%根据生产现状杂质限度的规定毒性杂质严控：-遵守公认标准-不超越前期标准

-以相关安全实验数据为科学依据

-以保证临床安全为根本目的杂质限度的规定有效杂质宽管：-不能不管（三磷酸腺苷二钠、头孢拉定）-不超越前期标准

-以投入产出比等利弊平衡为科学依据杂质限度的规定非特定杂质：-不超越前期标准-一般不得过0.10%（2010年版）

-以安全实验和投入产出比等利弊平衡为科学依据辅料影响的排除-有关物质检查前沿色谱峰，易排除少峰，可定位，能排除多峰，难定位，不能排除

辅料对测定的干扰辅料对测定的干扰1、避免使用（辅料或方法）2、不排除可以（默认或校正）3、排除辅料干扰方法要明确、易重现、具可操作性、配混合液4、保证特定杂质（最具代表性降解产物）检出效果-不得已的最后一招

比较研究的标尺问题

-购买的对照品/标准品对照品/标准品

权威性

真实性

准确性-发票、标签、批号、分析报告单、盐基/碱基、水分详细精制方法、质量检验报告标定方法与结果

详细提取精制方法、质量检验报告、标定方法与结果详细合成精制方法、质量检验报告、标定方法与结果

纯化精制提取精制

合成精制

比较研究的标尺问题

-非购买的对照品/标准品建立标准时要考虑的问题Growth200820072006200520042003200220012000数据标定：用正确的方法由至少3位实验者，不同仪器进行不少于10个数据的测定

待标品质量考察：证明不仅是对的而且还是好的

对数据进行数理统计处理

比较研究的标尺问题

-对照品/标准品的标定标定者测定结果（%）n均值（%）RSD（%）

1.98.82%，99.12%，99.18%，99.25%，99.17%599.11%

0.17%2.98.96%，99.04%，99.24%，98.98%，98.98%599.04%

0.12%3.99.12%，98.94%，99.04%，99.04%，99.18%599.06%

0.09%经Corchan检验，三位标定者的方差没有差异，均来自同一正态分布。用Dixon法检验15组数据中的最大值99.25%，最小值98.82%均非离群值。

T1-0.05×S置信区间μ=X±=99.08±0.068n1/2标定结果的置信区间为99.15~99.01%，因此，本批对照品的色谱纯度总均值为99.08%。对比研究≠对比检验研究项目≠原执行标准考察方法≠原法定标准

比较研究的范围与方法

-考察项目与方法的选择原则

物料不同－原料、辅料分析对象｛工艺不同－路线、中间体设备不同－质材、参数精度不全面－没的学（复方无有关物质）已有标准｛不完善－不应学（地标升国标标准）不适用－不能学（厂送设备）

为什么呢？产品生产个性应关注标准隐性变化同类最新动态

如何在已有标准基础上变化拓展项目原研厂标准拟定标准EP7.0USP34JP15含量限度按干燥品计算，每1mg的效价不得少于150单位按干燥品计算，每1mg的效价不得少于150单位按干燥品计算，每1mg效价不得少于150I.U.（非口服制剂），每1mg效价不得少于120I.U.（口服制剂按干燥品计算，每1mg中效价不得少于180USP肝素单位每1mg的效价不得少于110单位。性状白色或类白色的粉末，有引湿性白色或类白色的粉末，极具引湿性白色或几乎白色的粉末，有适度的引湿性白色到灰棕色的粉末或颗粒溶解度在水中易溶在水中易溶，在乙醚中不溶在水中易溶在水中溶解，在乙醚中不溶比旋度不小于+35°(40mg/ml,水)应不小于+50°(40mg/ml,水)鉴别1、电泳法2、钠盐1、电泳法2、钠盐A、具有抗凝血作用B、比旋度C、电泳法：D.钠盐A、H-NMRB、IC法C、抗Xa/抗IIa：D、钠盐酸碱度5.0～7.5（0.10g到10ml水）5.0～7.5（0.10g到10ml水）5.5～8.0（0.10g到10ml水）5.0～7.5（0.10g到10ml水）6.0～8.0杂质研究技术柱串联技术适用于溶解度无明显差异但电荷上有明显差异的难分离物质，通过将一根SCX（阳离子交换）短柱与一根MGⅡC18长柱串联就可以简单达到将其分离的目的。原理：有电荷差异的被分离物质进入色谱柱串联系统后，带正电荷的物质（通常是碱性物质）会由于SCX短柱的离子交换作用而被保留在短柱中，而带负电荷的物质（通常为酸性物质）与中性物质则会毫无阻碍的通过短柱进入C18长柱中，从而成功分离；然后由于MGⅡC18长柱中疏水性基团间的相互作用而对中性物质有强保留作用，但对带负电荷物质无强保留作用，这样带负电荷物质与中性物质也简单被分开了如果为了让峰形更好，各峰间分离更开，还可在阳离子交换短柱与C18长柱前接一根NH2短柱（它可与阴离子发生交换作用），进行三根串联，也可以使带负电荷的酸性物质与中性物质达到更好的分离效果。

毒性快速评价平台斑马鱼毒性快速评价平台，对杂质的胚胎毒性、神经毒性，心脏毒性等进行评价。优点：杂质用量少无需知道杂质结构实验周期短（3－4天一个周期）药物耳毒性检测利用一种特殊染料对斑马鱼幼体头部耳蜗区神经丘毛细胞的染色，检测毛细胞的存活状态，来判断检测物的耳毒性。下图中红色圈示耳蜗区域；给药组中红色箭头示给药后毛细胞减少，黄色圈示给药后1神经丘消失。给药后系统对照组（正常幼体）药典采用现代分析技术举例

由于某些药物组成的复杂性，特