可见分光光度法和紫外分光光度法

可见分光光度法和紫外分光光度法第1页，共20页，2023年，2月20日，星期三内容提要物质的吸收光谱分光光度法基本原理透光率和吸光度Lambert-Beer定律可见分光光度法分光光度计测定方法提高测量灵敏度和准确度的方法紫外分光光度法简介第2页，共20页，2023年，2月20日，星期三教学基本要求了解光的基本性质及物质对光的选择性吸收。了解吸收光谱的意义。掌握分光光度法的基本原理，Lambert-Berr定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数、质量吸光系数等基本概念及相互关系。了解光的加和性。了解分光光度计的基本构造，熟悉可见分光光度法的测定方法­标准曲线法和标准对照法，了解比吸光系数比较法和差示分光光度法。了解提高测量灵敏度和准确度的方法。了解紫外分光光度法的一般概念第3页，共20页，2023年，2月20日，星期三第一节物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。M(基态)+hM*(激发态)物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。第4页，共20页，2023年，2月20日，星期三第一节物质的吸收光谱第5页，共20页，2023年，2月20日，星期三第一节物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。一般，max是定性鉴别物质的基础。不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。第6页，共20页，2023年，2月20日，星期三第一节物质的吸收光谱三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图max=510nm不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比。第7页，共20页，2023年，2月20日，星期三第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0

═Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═Ia+It第8页，共20页，2023年，2月20日，星期三第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。第9页，共20页，2023年，2月20日，星期三第二节分光光度法基本原理二、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律：A=bc

溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位molL-1；摩尔吸光系数，单位Lmol-1cm-1

若用质量浓度代替cA═ab

质量吸光系数a的单位Lg-1cm-1

a和可通过下式相互换算

═aM

第10页，共20页，2023年，2月20日，星期三第三节可见分光光度法一、分光光度计主要部件光源单色光器检测器吸收池讯号处理及显示器光源：钨灯，发出320~3200nm的连续光谱，单色光器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。第11页，共20页，2023年，2月20日，星期三第三节可见分光光度法(a)自准式单色光器示意图(b)棱镜对光的色散作用第12页，共20页，2023年，2月20日，星期三第三节可见分光光度法二、测定方法标准曲线法取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。维生素B12的标准曲线

第13页，共20页，2023年，2月20日，星期三第三节可见分光光度法二、测定方法标准对照法预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得第14页，共20页，2023年，2月20日，星期三第四节提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差溶液偏离Beer定律偏离Beer定律，A-c曲线弯曲。主要原因：化学因素吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象；光学因素复色光引起对Beer定律的偏离。两种不同吸光系数的混合光对Beer定律的偏离第15页，共20页，2023年，2月20日，星期三第四节提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差仪器测定误差光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。透光率误差T引起浓度误差c：透光率20%~65%，A为0.2~0.7时，浓度相对误差较小。测量误差和透光率的关系第16页，共20页，2023年，2月20日，星期三第四节提高测量灵敏度和准确度的方法三、选择合适的测定条件波长的选择显色剂的用量溶液的酸度显色时间和温度共存离子的干扰及其消除第17页，共20页，2023年，2月20日，星期三第五节紫外分光光度法简介一、751-G型分光光度计紫外分光光度法适用测定在近紫外区(200~380nm)有特征吸收的物质。751-G型分光光度计装有可转换的适用于可见分光光度法的钨灯光源和适用于紫外分光光度法的氢(氘)灯光源(发射200~400nm)。紫外光不能透过玻璃，故紫外分光光度计中棱镜、透镜、氢灯和光电管以及吸收池等均须用石英制造。第18页，共20页，2023年，2月20日，星期三第五节紫外分光光度法简介751-G分光光度计光学系统简图1.钨灯2.氢灯3.凹面反射镜4.平面镜5.狭缝6.准直镜7.石英棱镜8.透镜9.吸收池10.蓝敏光电管11.红敏光电管第19页，共