干细胞技术模板

干细胞技术模板第1页/共94页2023/4/41.个体发育历史研究回顾作为多细胞的聚集物，人体不仅由数以亿计的细胞构成，而且更重要的是这些细胞分成了不同的细胞类型。实际上这些不同类型的细胞有些在外形上差异极大，功能也不同。第2页/共94页2023/4/4人们早就知道构成人体的所有细胞均来自于一个细胞——受精卵，但在历史上对受精卵如何发育成个体，却争论了许久。其中一个重要的流派是先成论（或者称预成论）者，他们主张在受精卵中其实已经预先有了一个微型的胎儿，随后的发育过程仅仅是一个简单的生长过程，你也可以把它理解成一个放大的过程。第3页/共94页2023/4/4而更加激进的预成论者断言，在这个微型胎儿的更加微型的精子和卵子中应该还含有它们自己的微型胎儿，以此类推直到无穷。就像那个著名的俄罗斯套装娃娃，一个套一个。第4页/共94页2023/4/4预成论者的说法，在今天听来实在是过于荒唐，不过这也不能就此论定他们就很愚蠢。无论如何不同物种的受精卵不管看起来多么相似，然而它们却注定了要发育成不同的物种。很显然在受精卵中一定得有些什么保证这一切的有序发生，预成论者犯的错误在于将这个问题简单化和庸俗化了。第5页/共94页2023/4/4伴随着人们对细胞的认识逐步加深，人们逐步的确信细胞来自细胞，而细胞的繁殖也决不是一个简单的放大。那么在个体的发育中，胚胎发育的遗传控制形式究竟是什么？对此德国遗传学家魏斯曼提出了一个解决胚胎发育的遗传控制的非常有创见的方案，同时也是第一个真正完整的遗传学说。第6页/共94页2023/4/4魏斯曼对于初始的全能细胞，如何分化为个体中不同类别的细胞上，魏斯曼面临两种选择，非常不幸的是限于当时的背景，魏斯曼放弃了他的第二种假说——激活学说，而选择了第一种——分割学说。分割学说的意思简单来说，就是在细胞分裂的时候，是进行的不等分裂，一个全能的细胞就此不断的分化，最终形成特化的功能细胞。第7页/共94页2023/4/42.什么是干细胞现在我们都知道，在细胞分裂的过程中，是进行的均等分裂，也就是说不仅两个子代细胞是一样的，而且它们和母本细胞也是一样的。而分化的发生依赖的是激活一些相关的基因以及关闭其他的基因。对于这整个过程具体是怎么进行的，我们依然所知甚少。虽然我们已经取得了一些非凡的成功，比如克隆羊之类的搅得世界天翻地覆的事。第8页/共94页2023/4/4为什么克隆羊的成功如此让科学家们兴奋呢？这主要是对于大多数哺乳动物而言，已分化的细胞，不再能转变为其它类型的细胞。换句话说，它们已经被固定了，犹如大树上伸展的枝桠，无论这枝桠多么壮观，但是它们注定了不是主干，只有主干才能发出所有的枝桠。维尔穆特和克隆羊“多莉”在一起

第9页/共94页2023/4/4干细胞如同树木的主干一样，也有许多层次。所以有全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞这些不同的分类。第10页/共94页2023/4/4干细胞(stemcell)定义：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

第11页/共94页2023/4/4胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方面遇到很大的障碍。3.胚胎干细胞研究的伦理挑战第12页/共94页2023/4/41）胚胎干细胞的来源是否符合法律与道德？2）胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法律问题？3）该项研究是否会导致人流泛滥？或导致医生刻意造成胚胎流产？4）如何看待克隆人的研究？

3.1存在的问题第13页/共94页2023/4/41）认为胚胎干细胞研究破坏人类生命，其观念基于人类生命起始于早期胚胎。2）天主教派极力反对胚胎干细胞研究，认为用人类胚胎干细胞进行研究是一种“邪恶”。

3.2反对者的观点第14页/共94页2023/4/4科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项研究。2001年4月，JamesWatson博士(DNA双螺旋结构发明人、冷泉港实验室主任)倡导发起了由80位诺贝尔奖获得者参加的签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。3.3支持者的观点第15页/共94页2023/4/44干细胞生物学

干细胞是个体发育和组织再生的基础，特定组织通过使自身细胞死亡和增生的方式保持组织细胞数量动态平衡的特征称组织自稳定性。第16页/共94页2023/4/41．干细胞的形态特征①干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强。②干细胞的固定组织位置：有的干细胞有固定存在部位与方式。如表皮干细胞与其周围的子细胞形成增殖结构单元。但许多组织的干细胞没有这种分布特点。4.1干细胞的形态和生化特征

第17页/共94页2023/4/4①端粒酶活性高：如造血干细胞具癌细胞的端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降。②蛋白标志分子：不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白—神经干细胞；角蛋白15—表皮干细胞。

2．干细胞的生化特性第18页/共94页2023/4/41)干细胞增殖速度慢：细胞动力学研究表明，干细胞的增殖速度较慢，组织中快速分裂的细胞是过渡放大细胞。如小肠干细胞的分裂速度(Tc=11h)比过渡放大细胞(Tc≥24h)慢一倍。1.增殖缓慢性4.2干细胞的增殖特征第19页/共94页2023/4/42)过渡放大细胞：过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，过渡放大细胞经若干次分裂产生分化细胞。通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多分化细胞。第20页/共94页2023/4/43)干细胞增殖缓慢的意义：(1)利于干细胞对外界信号作出反应，以决定细胞的发展方向—增殖或分化。(2)减少基因突变的危险。增殖缓慢使干细胞有时间发现并纠正处于增殖周期过程中的错误。第21页/共94页2023/4/41)自稳定性：自稳定性是干细胞的基本特征之一。指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定。干细胞的自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征。干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。2.干细胞的自稳定性第22页/共94页2023/4/42)干细胞的分裂方式干细胞有对称与不对称两种分裂方式。对称分裂：干细胞

分裂干细胞干细胞对称分裂：干细胞

分裂分化细胞分化细胞不对称分裂：干细胞

干细胞分化细胞分裂第23页/共94页2023/4/4

不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为功能专一的分化细胞；另一个保持干细胞的特征。3)不对称分裂发生原因：①系列基因调控。②细胞质物质不均等分配。第24页/共94页2023/4/44)无脊椎动物通过不对称分裂维持自稳定性。如：果蝇的Insc基因是感官前体细胞的不对称分裂的调控基因之一，通过三个途径进行调控：不对称分配质膜上的细胞定向决定因子。不对称分配细胞内的mRNA。决定细胞分裂时纺锤体的取向。第25页/共94页2023/4/45)哺乳动物的种群不对称分裂。(1)种群不对称分裂：哺乳动物有几种不同的干细胞群，分裂后产生不同细胞。干细胞→分化细胞干细胞→干细胞→祖细胞3→分化细胞祖细胞1→分化细胞祖细胞2→分化细胞第26页/共94页2023/4/4(2)哺乳动物种群不对称分裂的意义：①使机体对干细胞的调控更灵活，以适应机体的生理变化。②要求机体对干细胞分裂的调控更精确，以保持干细胞数目恒定。第27页/共94页2023/4/4(3)哺乳动物种群不对称分裂的调控。哺乳动物通过多层次多角度调控，保持自稳定性。正调控：促进与细胞增殖、生存有关的基因表达。负调控：促进与细胞凋亡有关的基因表达。如转基因小鼠长期造血干细胞高表达Bcl-2后，使长期造血干细胞的数目显著增加。说明细胞凋亡也是干细胞的调控方式。

第28页/共94页2023/4/4根据其分化潜能大小，干细胞可分为三类:

全能干细胞多能干细胞专能干细胞1.干细胞的分化潜能4.3干细胞的分化特征

第29页/共94页2023/4/41)全能性干细胞(胚胎干细胞)：具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞(ES)具有很强的分化能力，可无限增殖并分化为全身200多种细胞类型，及机体的各种组织、器官。第30页/共94页2023/4/42)多能性干细胞：多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。第31页/共94页2023/4/43)专能性干细胞(成体干细胞)：专能干细胞(也称单能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞(卫星细胞)。第32页/共94页2023/4/41)干细胞的转分化：一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞的过程称干细胞的转分化。2.干细胞的转分化和去分化第33页/共94页2023/4/4实验：C57BL/6J♂成年小鼠造血干细胞WBB6F/J-KitW/KitW-V♀鼠(亚致死剂量同位素照射)在♀鼠的神经胶质细胞中检测到Y染色体.即♂鼠的造血干细胞移植到♀鼠中分化为脑星形胶质细胞。移植分离3天第34页/共94页2023/4/42)干细胞去分化：一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称干细胞去分化。实验：成体鼠造血干细胞鼠卵泡的内细胞团表达胎鼠的珠蛋白基因→参与胚胎造血系统的发育。注入分化状态逆转第35页/共94页2023/4/41)干细胞的横向分化：在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为与其组织来源一致的细胞。但有时供体干细胞会分化出与其组织来源不一致的其它细胞，这种现象称干细胞横向分化(trans-differentiation)。3.干细胞的可塑性第36页/共94页2023/4/4干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗提供了可能。2)实验：小鼠肌肉干细胞→体外培养5天＋少量骨髓间质细胞接受致死量辐射的小鼠中各种血细胞系。植入分化第37页/共94页2023/4/43)横向分化的调控机制：与干细胞的微环境有关。干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。第38页/共94页2023/4/41．胚胎干细胞：从囊胚期(受精后5~7天)胚胎分离到的干细胞称胚胎干细胞。2．胚胎干细胞的特性：为全能性干细胞。有如下特性：可在体外无限增殖并保持未分化状态。具有分化为完整个体的潜能。具有分化为所有种类的细胞、器官的潜能。5胚胎干细胞第39页/共94页2023/4/43．胚胎干细胞的研究价值：是发育生物学基础研究的理想模型和有效工具。研究细胞分化研究基因功能研究基因表达第40页/共94页2023/4/45.1人胚胎干细胞的获得要研究胚胎干细胞，首先要获得胚胎干细胞。(一)获得途径：主要有：从早期胚胎获得2.从原始生殖细胞获得3.从移植细胞(克隆细胞)获得第41页/共94页2023/4/41．从早期胚胎获得美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：体外受精卵囊胚期去除滋养层→内细胞团得5株干细胞系

32代(8个月)保持未分化状态。

传代培养发育免疫切除法第42页/共94页2023/4/42．从原始生殖细胞获得gearhart小组：流产胎儿性腺嵴原始生殖细胞获得5个多能干细胞系7个月不分化。

思路：原始生殖细胞是未分化细胞。培养

分离培养第43页/共94页2023/4/43．体细胞移植分化细胞核(乳腺、皮肤细胞)

去核卵细胞→杂合细胞发育成囊胚胚胎干细胞成体(如多利羊)。

分离发育

移植

刺激第44页/共94页2023/4/41.形态和生化特征1)形态：细胞体积小，核大，1~多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。2)生化特征：端粒酶活性高。3)干细胞物理特性：如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine123染料不着色。5.2胚胎干细胞的主要特征第45页/共94页2023/4/44)干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。第46页/共94页2023/4/42.干细胞的分离与纯化1)借助细胞的生化特征及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞;2)干细胞的理化特征与其分化调控有关，如上皮干细胞高表达β1整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。第47页/共94页2023/4/43.干细胞的体外培养由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。第48页/共94页2023/4/41)培养条件：需要许多生长因子和间质细胞的共培养。如Brustle等在体外培养了鼠的ES细胞。分离ES细胞培养培养生长增殖保持分化潜能。停止供给生长因子，ES细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。EGF培养基FGF2+PDGFFGF2培养基第49页/共94页2023/4/42)分化诱导在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。分化诱导需了解：①干细胞发育有关的信号调节；②干细胞发育的微环境。第50页/共94页2023/4/44.胚胎干细胞的分化潜能胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。第51页/共94页2023/4/4实验：移植实验人胚胎干细胞小鼠体内畸胎瘤(良性)→有三个胚层产生的组织：移植发育胃上皮(内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层)第52页/共94页2023/4/46.精原干细胞精原干细胞来自原始生殖细胞。胚胎外胚层原始生殖细胞双侧生殖腺嵴生精索(

曲细精管)

生精母细胞(精原干细胞的前体细胞)

成体精原干细胞分化分化迁移发育形成空隙sertoli前体细胞第53页/共94页2023/4/46.1精原细胞的增殖和

干细胞的再生1．精原细胞的形态特征：精原细胞紧贴于曲细精管的基膜，圆形或卵圆形，φ12μm，核大，除核糖体外其它细胞器不发达。第54页/共94页2023/4/42．精原细胞的增殖与类型：精原细胞分为A型和B型。A型：常染色质丰富，核仁常靠近核膜，根据在曲细精管局部的排列特征，又分为Asingle、Apaired和Aaligned三种类型。B型：分化型精原细胞。第55页/共94页2023/4/41．分化Aal型精原细胞A1型精子A1型精原细胞是精子形成的不可逆的调控点。机体对这一调控点有相当严格的控制。分化分化6.2精原细胞的分化及其控制第56页/共94页2023/4/42．分化控制(1)精原细胞分化抑制的影响因素：动物模型研究表明，精子发生存在可逆性抑制，使A1型精原细胞不分化而增殖。其影响因素如sertoli细胞的中毒、辐射损伤、维生素缺乏甚至睾丸温度升高等。第57页/共94页2023/4/4(1)

细胞毒性药物致分化抑制sertoli细胞毒性药物2，5-己二酮小鼠A1型精原细胞不能分化。用促性腺激素释放激素的激动剂治疗后，药物导致的分化抑制得以缓解。说明激素水平可以调节生殖细胞的分化。作用5周第58页/共94页2023/4/4(2)

Kit受体的作用①Kit受体：即干细胞生长因子受体。属于生长因子受体类的原癌基因产物。②作用：原始生殖细胞表达Kit受体，sertoli细胞分泌干细胞因子(SCF)。SCF通过与Kit受体结合促进细胞增殖。第59页/共94页2023/4/4③干细胞因子：有两种形式在已二酮(hexanedione)导致精子发生衰退的大鼠中，sertoli细胞表达可溶性因子，经激素治疗后，膜包被型数量增加。可溶型促进增殖膜包被型促进分化第60页/共94页2023/4/4(3)

VitA的作用VitA缺乏→精细胞退化，补充VitA或维甲酸→分化重新开始推测：A型精原细胞中有维甲酸的核内受体，因此维甲酸对A型精原细胞有作用，但这种作用依赖sertoli细胞。第61页/共94页2023/4/43.精原细胞的凋亡精子发生过程中通过细胞凋亡调节分化型精原细胞的密度。分化型精原细胞在曲细精管不同部位差别很大，但原始生殖母细胞密度变化很小，是因为分化型的精原细胞在不同部位选择性地凋亡。第62页/共94页2023/4/4精子发生过程中的凋亡相关基因

凋亡促进基因：ICE(IL-1-βconvertingaenzyme)

bax,p53,ICH-1，fas等。凋亡抑制基因：bcl-2,crmA等。第63页/共94页2023/4/47成体干细胞成体组织或器官中，许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血液细胞、皮肤细胞、受损的肝组织细胞等。这些细胞即是成体干细胞.第64页/共94页2023/4/47.1造血干细胞造血干细胞是第一种被认识的组织特异性细胞。1961年Till和McCulloch首次通过小鼠脾集落形成实验证实造血干细胞在成体内的存在。第65页/共94页2023/4/41．形态：一般认为造血干细胞的形态类似小淋巴细胞。2．细胞表面标志：表面标志比较多，临床上应用最多的是CD34。还可与KDR(kinaseinsertdomainrecepter)配合鉴定造血干细胞和造血祖细胞。造血干细胞：CD34+KDR+造血祖细胞：CD34+

KDR-第66页/共94页2023/4/43．造血干细胞的胚胎发生中胚层细胞造血环境(大动脉、性腺脊、中期肾区)

胎肝髓系及淋巴系的前体细胞骨髓迁移出生前迁移迁移分化第67页/共94页2023/4/44．造血干细胞的调控(1)维持造血干细胞的数目恒定：干细胞因子(2)影响干细胞的移行、数目维持、分化：成纤维细胞生长因子(FGF-1，FGF-2)、SDF-1、细胞外基质。第68页/共94页2023/4/47.2间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)

第69页/共94页2023/4/41．间充质干细胞的位置间充质干细胞附着于骨髓窦的内腔面，形成一种包埋于窦状网络中的三维细胞网络。第70页/共94页2023/4/42．MSC的分离与表面标志(1)分离：骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的细胞，贴壁生长的细胞中95~98%为MSC。根据细胞表面抗原获得MSC。第71页/共94页2023/4/4(2)MSC的特异性表面标志通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。第72页/共94页2023/4/43．间充质干细胞的分化方向间充质干细胞可分化为多种间充质组织。如骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质等。来源不同或在不同条件下，间充质干细胞可分化相应组织细胞。第73页/共94页2023/4/4如骨髓中的间充质干细胞可分化脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。在含有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛的培养基中，95%间充质干细胞分化为脂肪细胞。在含TGF-β3的无血清培养基中，间充质细胞会分化为软骨细胞。第74页/共94页2023/4/4由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨细胞、软骨细胞，可在骨损伤、先天性骨畸形有治疗中有广泛应用。第75页/共94页2023/4/47.3神经干细胞传统观点：神经细胞无再生能力。新发现：中枢神经系统中部分细胞仍具有自我更新及分化产生成熟脑细胞的能力，这些细胞被称为神经干细胞。第76页/共94页2023/4/41．神经干细胞的存在部位哺乳动物中脑侧室的室管膜下区包括室管膜的细胞中存在有增殖能力的干细胞。成体的下脑室区、嗅球及海马区是神经干细胞存在的部位。第77页/共94页2023/4/42．神经干细胞的生化特性神经干细胞表达巢素蛋白，所有的神经干细胞都巢素蛋白阳性。巢素蛋白的表达始于神经胚形成期，当神经细胞迁移基本完成后，合成开始下降，神经细胞完成分化，巢素蛋白表达停止。第78页/共94页2023/4/43．神经干细胞的维持与分化(1)促进细胞增殖的因素：表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，对干细胞的存活、增殖和分化起重要作用。EGF的主要作用是维持神经干细胞生存；FGF-2主要是对细胞分化起作用。第79页/共94页2023/4/4(2)促进神经干细胞分化的因素：小牛血清。用小牛血清替代EGF培养神经干细胞，细胞分化为星形胶质细胞、少突状细胞和神经元；巢素蛋白逐渐减少，出现神经元特有的微管结合蛋白–2及胶质细胞的特征性神经胶质原纤维酸性蛋白。第80页/共94页2023/4/47.4表皮干细胞第81页/共94页2023/4/41．表皮干细胞的存在部位(1)表皮干细胞位于表皮基底层。属于专能干细胞。能周期性的进入分化程序，最终分化为角质细胞。(2)表皮增殖单位：位于基底层的干细胞和分布在它周围的由它分裂形成的子细胞，共9个，组成一个柱状细胞群，称为一个表皮增殖单位。第82页/共94页2023/4/4(3)表皮干细胞的分化：表皮增殖单位边缘的子细胞脱离基底膜后向上迁移经过棘细胞层和颗粒层细胞，最终形成角质化无核细胞。这层细胞不断脱落，由新生的细胞不断补充。人体不同部位的皮肤更新速度约2~4周。在细胞迁移过程中，角质化伴随着分化过程。第83页/共94页2023/4/42．表皮干细胞的生化标志

(1)表达角蛋白5(keratin5，K5)和K14分子：同角细胞相同。