单基因遗传疾病的分子诊断殷

第11章

单基因遗传病

的分子诊断

单基因遗传病：一对等位基因控制常染色体遗传X连锁遗传单基因遗传病线粒体遗传基因结构异常表达异常第一节策略第二节遗传病的分子诊断第三节产前诊断一、血红蛋白病二、血友病三、肌营养不良症四、苯丙酮尿症五、囊性纤维化六、亨廷顿病七、脆性X综合征一、血红蛋白病珠蛋白基因簇16p13.33-p13.1111ｐ15.5珠蛋白基因簇:血红蛋白的类型成人Hb：HbA2297～98%

HbA2

222～3%胎儿Hb：HbF22

α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22

ζ2Gγ2ζ2Aγ2

HbGowerⅡ22

HbPortland22

血红蛋白病hemoglobinopathy

结构异常

镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病血红蛋白M病氧亲和力改变表达异常（地中海贫血）

珠蛋白的合成降低或消失1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞

带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)镰刀状细胞贫血分子机制

GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG正常的（N）的ASO探针：5´-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3´突变的（M）的ASO探针：5´-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3´1.镰刀型贫血病--ASO杂交法斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测N-ASOM-ASO正常突变突变

纯合子杂合子纯合子5´3´正常基因1.15kb(CCTGAGG)×5´3´突变基因1.35kb(CCTGTGG)MstⅡ酶切2.HBS的限制性内切酶谱分析目录0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目录3.HBS的PCR-RFLP分析

正常人的扩增产物经MstⅡ消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带正常人杂合体患者MarkerPCR-SSCP(单链构象多态性,single-strand

conformation

polymorphism)

当双链DNA变性为两条单链后，各自会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现各自电泳条带。如果DNA序列发生变化，甚至只有一个碱基变化，空间构象也有可能发生变化，电泳条带也随之变化。PCR-SSCPSβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstII

CCTNAGG

GGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSASβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeI

CTNAG

GANTC268bpASSA175bp175268443

2.地中海贫血

由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。α地中海贫血β地中海贫血γ地中海贫血δ地中海贫血α地中海贫血

16号染色体有两个α基因（α－）为α+地贫，α链减少。（－－）为α0地贫，α链不合成。临床类型类型症状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血HbBart’s胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿胎儿水肿

HVRψξ13’5’ca2

HVRψξ1

ψ2

ψ113’5’abcNormal(a+b)=1050bpMutant(a+c)=740bpLocationofPrimersandDetectionofthe--SEADeletionbyGap-PCRM12345678910HeterozygoteHomozygoteNormalNormalMutantDirectGenotypingofthe--SEADeletionbyDHPLCAssay––SEA/––SEA

//––SEASEAtypeofdeletion2

HVRψξ1

ψ2

ψ113’5’cdabNormal(a+b)=885bpMutant(c+d)=813bpPCR

DHPLCDetection

DNASamples非缺失型（点突变）无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等结果1

生成无功能或稳定性降低的mRNA

无义突变移码突变终止密码突变起始密码突变

2

RNA加工突变

3

产生不稳定Hbβ地中海贫血

β珠蛋白Gene突变或缺失→β珠蛋白链合成速率下降→溶血性贫血

β0

地贫：β链完全不能合成

β+地贫：β链可部分合成β-地中海贫血临床分类临床类型基因型基因产物临床表现重型地贫+/+、0/00/0、+/0链几乎不能合成链合成相对增加HbF和HbA2增高地中海贫血面容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量的链贫血不明显或轻度贫血中间型地贫+/+

链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白持续增多症缺失或突变链和链合成受抑制链合成明显增加成人HbF持续增加，无症状患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。-地中海贫血的分子基础

地中海贫血已发现100多种突变类型，包括点突变和基因缺失。绝大多数地中海贫血是由于基因发生点突变所致，突变涉及基因内及侧翼序列。（1）编码区突变（2）非编码区突变（3）启动子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变☆编码区突变

——mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变密码子17：A→C

密码子43：G→Tβ0地贫（2）移码突变密码子71/72：+A

密码子41/42：－TCTTβ0地贫（3）起始密码突变

ATG→AGGβ0地贫⑴内含子IGT→AT丧失一个剪切信号。⑵新的切点产生同义突变→激活→I和Exon隐蔽裂解位点如：GGT→AGT产生新的剪切点☆非编码区突变

——影响mRNA剪切、加工过程GT→ATGGT→AGT，激活隐蔽剪切位点☆启动子区突变

——降低mRNA的转录效率-28位A→G突变破坏了TATABox。☆RNA裂解信号突变

——不能准确裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’侧翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位点单个碱基突变

——不能准确裂解和加polyA加帽位点发生A→C颠换，影响转录效率。通常是mRNA的第一个核苷酸。分子诊断方法

PCR反向点杂交(PCR-RDB)法PCR—RFLP法基因芯片法等-地贫诊断--反向斑点杂交ReverseDotBlot（RDB）ReverseDotBlot（RDB）analysis:反向斑点杂交-29-28cd17cd261-11-5cd27/28cd41/42NormalMutant

NMNMNMcd43cd71/72654二、肌营养不良症X连锁性隐性遗传，患者都为男孩。肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变。细胞膜不稳定，通透性增加而变性或坏死。

2．分子诊断

(1)多重PCR技术（2）短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)连锁分析（3）定量PCR技术

三、血友病缺乏凝血第8因子(FⅧ)--甲型。缺乏凝血第9因子(FⅨ)--乙型。甲型血友病分子机制

（二）乙型血友病及其分子诊断FⅨ基因缺陷，导致FⅨ含量缺乏或结构异常，从而凝血功能障碍。直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)；间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱(dideoxyfingerprint,ddF)、变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）四a1-抗胰蛋白酶缺乏症是蛋白酶抑制剂,侵入组织,与中性粒细胞释放的蛋白水解酶(主要弹性蛋白酶)结合抑制其活性,减少组织损伤.儿童缺乏引起肝病;成人引起肺气肿.苯丙氨酸酪氨酸苯丙氨酸羟化酶苯丙酮酸（苯丙酮尿症）

苯丙氨酸转氨酶五、苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)(二)分子诊断1．PCR－STR连锁分析2．PCR-SSCP法3．PCR-RFLP4．多重ASPCR法

六、亨廷顿病（Huntington'sdisease,HD)4号染色体上IT15基因CAG重复序列异常。常染色体显性遗传。舞蹈运动为特征的神经退行性疾病。

异常蛋白质积聚成块，形成包涵体，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。

正常：9～30个拷贝。HD患者：大于35-100个或更多。拷贝数目与HD的发病年龄负相关。突变率在单基因遗传性疾病中最低。HD的分子诊断PCR扩增鉴定IT15基因（CAG)ｎ串联重复序列拷贝数。

七脆性X综合征（fragileXsyndrome,FraX）1．FMR-15′端(CGG)n重复异常2．FMR-15′端CpG岛的异常甲基化3．缺失4．点突变脆性X综合征的分子诊断