第二代测序数据分析原理详解演示文稿

第二代测序数据分析原理详解演示文稿现在是1页\一共有65页\编辑于星期五优选第二代测序数据分析原理现在是2页\一共有65页\编辑于星期五三代DNA测序技术之比较第一代测序技术：Sanger测序法第二代测序技术：454测序……

第三代测序技术：？直接测序法：？4/3/20233现在是3页\一共有65页\编辑于星期五第一代测序技术：

Sanger测序法

——简便、快速4/3/20234现在是4页\一共有65页\编辑于星期五逐渐被遗忘的测序技术：

Maxam-Gilbert的DNA化学降解法

4/3/20235现在是5页\一共有65页\编辑于星期五Sanger测序的局限通过几十年的改进，第1代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generationsequencing)应运而生。4/3/20236现在是6页\一共有65页\编辑于星期五概要主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择现在是7页\一共有65页\编辑于星期五第二代测序技术454测序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……4/3/20238现在是8页\一共有65页\编辑于星期五4544/3/20239现在是9页\一共有65页\编辑于星期五SOLID4/3/202310现在是10页\一共有65页\编辑于星期五Illumina4/3/202311现在是11页\一共有65页\编辑于星期五其他PolonatorCompleteGenomics……4/3/202312现在是12页\一共有65页\编辑于星期五4/3/202313现在是13页\一共有65页\编辑于星期五第二代测序技术的共同点1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子结合到固相表面3单分子独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统。4/3/202314现在是14页\一共有65页\编辑于星期五第二代测序技术的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。4/3/202315现在是15页\一共有65页\编辑于星期五第三代测序技术：单分子测序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……4/3/202316现在是16页\一共有65页\编辑于星期五4/3/202317现在是17页\一共有65页\编辑于星期五直接测序法在所有上述三代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。4/3/202318现在是18页\一共有65页\编辑于星期五4/3/202319现在是19页\一共有65页\编辑于星期五4/3/202320现在是20页\一共有65页\编辑于星期五SecondgenerationsequenceRoche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seq

RNA-seq现在是21页\一共有65页\编辑于星期五ExperimentsDNA-seq:denovo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylatedDNA(epigenome)现在是22页\一共有65页\编辑于星期五主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择现在是23页\一共有65页\编辑于星期五SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled现在是24页\一共有65页\编辑于星期五现在是25页\一共有65页\编辑于星期五现在是26页\一共有65页\编辑于星期五现在是27页\一共有65页\编辑于星期五 全基因组denove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovoVelvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler现在是28页\一共有65页\编辑于星期五分析所需工具BowtiesoftwareSAMtoolsTopHatsoftareCufflinkssoftwareCummeRbundsoftware现在是29页\一共有65页\编辑于星期五外显子组分析工具PlatformAlignmentFindVariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnpsamtoolsSolidBioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler现在是30页\一共有65页\编辑于星期五主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择现在是31页\一共有65页\编辑于星期五常规分析TranscriptsquantificationSplicingsitesdiscoveryandquantificationGenediscoverySNP/INDELdetectionAllelespecificexpression现在是32页\一共有65页\编辑于星期五现在是33页\一共有65页\编辑于星期五现在是34页\一共有65页\编辑于星期五现在是35页\一共有65页\编辑于星期五UniGene拼接目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。

原理：应用deBruijngraphpath算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用HamiltonPath算法拼接。

结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图现在是36页\一共有65页\编辑于星期五现在是37页\一共有65页\编辑于星期五3.数据库注释目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释

原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对

结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计

现在是38页\一共有65页\编辑于星期五现在是39页\一共有65页\编辑于星期五UniGene表达分析目的：UniGene定量分析。

原理：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行referencemapping,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。

RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:现在是40页\一共有65页\编辑于星期五UniGene表达分布图，1X，5X分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系现在是41页\一共有65页\编辑于星期五UniGene样本间表达相关性散点图现在是42页\一共有65页\编辑于星期五样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达总体偏差现在是43页\一共有65页\编辑于星期五UniGene表达差异分析目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene

原理：双层过滤筛选差异基因

FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选

FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。

现在是44页\一共有65页\编辑于星期五组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势现在是45页\一共有65页\编辑于星期五差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布现在是46页\一共有65页\编辑于星期五GO功能分类

目的：利用数据库注释信息将UniGene进行GO功能分类。

原理：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在GeneOntology的三大类：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各个层次所占数目，一般取到14层。

结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及UniGene2GO关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。

现在是47页\一共有65页\编辑于星期五现在是48页\一共有65页\编辑于星期五现在是49页\一共有65页\编辑于星期五现在是50页\一共有65页\编辑于星期五现在是51页\一共有65页\编辑于星期五KEGG代谢通路分析目的：对拼接得到UniGene进行KEGGpathway映射。

原理：应用KEGGKAAS在线pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。

结果：标记的Pathway通路图。现在是52页\一共有65页\编辑于星期五现在是53页\一共有65页\编辑于星期五IPApathwayanalysis

(/)现在是54页\一共有65页\编辑于星期五COG注释目的：对拼接得到UniGene进行COG功能分类。

原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。

结果：COG分类分布情况图。现在是55页\一共有65页\编辑于星期五现在是56页\一共有65页\编辑于星期五SSR重复序列注释目的：对拼接得到UniGene进行SSR简单重复序列的查找。

原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。

结果：重复序列的信息文件以及统计文件。

现在是57页\一共有65页\编辑于星期五LncRNA预测目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(LongnoncodingRNA)预测。

原理：通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。

1)Unigenelength>200bp；

2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)l