分子生物学课件第五章基因表达调控真核生物

分子生物学课件第五章基因表达调控真核生物1第1页，共50页，2023年，2月20日，星期三

多细胞真核生物，遗传信息从细胞核的基因组DNA传递到基因编码的蛋白质均受到多层次的调控。第二节真核生物基因表达的调控第2页，共50页，2023年，2月20日，星期三一、真核生物基因表达的特点

1.细胞具有全能性

全能性：指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组DNA，都有发育成完整个体的潜能。2.基因表达的时间性和空间性

时间性：个体发育的不同阶段，基因表达的种类和数量是不同的；空间性：在不同组织和器官中，基因表达的种类和数量是不同的。第3页，共50页，2023年，2月20日，星期三3.转录和翻译分开进行真核生物DNA在核中转录生成mRNA，穿过核膜至胞质指导蛋白质合成；转录和翻译不是同步进行的，受多层次调控。

4.初级转录产物要经过转录后加工修饰初级转录产物为核不均一RNA

（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）第4页，共50页，2023年，2月20日，星期三5.不存在超基因式操纵子结构真核生物基因转录产物为单顺反子。6.部分基因多拷贝某些基因以多拷贝形式存在，如组蛋白和tRNA等，这样既可满足细胞的需要，也是表达调控的一种有效方式。第5页，共50页，2023年，2月20日，星期三单顺反子(monocistron)

编码一个多肽链的DNA的序列区域，相当于真核细胞的一个基因。第6页，共50页，2023年，2月20日，星期三translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene3′5′单顺反子mRNA

(monocistronicmRNA)第7页，共50页，2023年，2月20日，星期三（一）基因组DNA水平的调控1.染色质的丢失

不可逆的调控。线虫胚胎期：1090个细胞成虫：959个细胞

131个细胞在发育过程中发生凋亡二、真核生物基因表达的调控机制第8页，共50页，2023年，2月20日，星期三

2.基因扩增（geneamplification）

当细胞对某种基因产物需要量剧增，单纯靠调节其表达活性不足满足需要，只有增加这种基因的拷贝数。不适当的基因扩增可导致某些疾病的发生。第9页，共50页，2023年，2月20日，星期三3.基因重排（generearrangement）VJCVJCVJC免疫球蛋白IgG基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白分子的多样性奠定了基础

指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。第10页，共50页，2023年，2月20日，星期三BCR-ABL融合基因形成示意图(140kDa)(160kDa)第11页，共50页，2023年，2月20日，星期三4.基因的甲基化修饰

DNA上特定的CpG序列处的胞嘧啶发生甲基化修饰（5mC）。甲基化程度与基因的表达一般呈反比关系。甲基化程度愈高，基因的表达则降低。去甲基化，基因的表达增加。GCGCGCGCGene第12页，共50页，2023年，2月20日，星期三

DNA甲基化研究分析方法原理：甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的转录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基因转录活性。方法：选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基化敏感性内切酶对待测序列进行酶切。应用：分析抑瘤基因表达下调的机制；分析组织/发育阶段特异性基因的表达机制。

第13页，共50页，2023年，2月20日，星期三

5.染色质结构对基因表达的调控作用

组蛋白与DNA结合与解离是真核基因表达调控的重要机制之一。

非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。

常染色质中疏松状态的活性染色质是基因转录前在染色质水平上独特的调控机制。第14页，共50页，2023年，2月20日，星期三1.转录起始复合物的形成2.顺式作用元件(cis-actingelement)3.反式作用因子(trans-actingfactor)4.转录水平的调控机制（二）真核生物基因转录调控

以RNA聚合酶Ⅱ为例第15页，共50页，2023年，2月20日，星期三1.转录起始复合物的形成

转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)和转录起始复合物(transcriptioninitiationcomplex,TIC)的形成。真核生物RNApol不与DNA直接结合，而需要依靠众多的转录因子。

第16页，共50页，2023年，2月20日，星期三2.顺式作用元件(cis-actingelement)

指某些能影响基因表达但不编码新的蛋白质和RNA的DNA序列，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件（沉默子等）。第17页，共50页，2023年，2月20日，星期三

（

1）启动子(promoter)

在基因转录起始位点(+1)及其5′上游近端大约100～200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列。每个元件长度约为7～20bp，是决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件。第18页，共50页，2023年，2月20日，星期三

真核Ⅱ类基因的顺式作用元件图

①核心启动子(corepromoter)

包括“转录起始位点”及其上游-25～-30bp处富含TA的典型元件“TATA”盒。核心序列为TATAAAA，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。

②上游启动子元件(upstreampromoterelement,UPE)包括通常位于-70bp附近的CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG），功能：调节转录起始的频率，提高转录效率。第19页，共50页，2023年，2月20日，星期三

（2）

增强子(enhancer)

位于启动子上游或下游并通过启动子增强邻近基因转录效率的DNA顺序，增强子本身不具备启动子活性。第20页，共50页，2023年，2月20日，星期三(3)其他元件包括负调控元件和终止子等。负调控元件:沉默子（silencer）或衰减子（dehancer）

真核基因内能抑制基因转录的DNA序列，与反式作用因子相互结合而起作用。不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。第21页，共50页，2023年，2月20日，星期三终止子

在模板DNA分子的5′端转录终止信号。通常具有po1yA尾的基因终止信号为G／T簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT序列为终止转录调控元件。

第22页，共50页，2023年，2月20日，星期三3.反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件8～12bp核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。

在结构上含有与DNA结合的结构域。第23页，共50页，2023年，2月20日，星期三（1）反式作用因子根据作用方式分为三类：

①通用转录因子。普遍存在的转录因子。如TATAbox结合因子TFⅡD、GCbox结合因子SP1等。②组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性有很大关系。③诱导性反式作用因子。活性能被特异的诱导因子所诱导。第24页，共50页，2023年，2月20日，星期三（2）转录因子(transcriptionfactor，TF)

RNA合成起始所必需的因子。TF不依赖RNA聚合酶而独立地结合DNA，在转录过程中促使许多RNA聚合酶分子与启动子结合。第25页，共50页，2023年，2月20日，星期三(2)转录因子结构DNA结合域转录活化域TF结合其它蛋白质结构域（如，二聚化结构域）第26页，共50页，2023年，2月20日，星期三TFⅢA结构域示意图TFⅢA肽链的指结构域含有9个指，与相应的DNA序列结合，指“尖”可以进入DNA双螺旋的大沟或小沟。但羧基端不具有指结构，是RNA聚合酶Ⅲ和其它的转录因子相互作用的部位。第27页，共50页，2023年，2月20日，星期三

TATA因子与TATA盒结合，形成稳定的转录复合物，介导RNA聚合酶Ⅱ分子转录。

真核基因开放的转录起始复合物的形成图RNA聚合酶Ⅱ识别并结合以上蛋白质-DNA复合物。形成闭合复合物，DNA双链没有打开，不能启动转录。转录起始因子与RNA聚合酶结合，使DNA部分双螺旋解开成为开放的转录起始复合物，转录开始合成RNA。第28页，共50页，2023年，2月20日，星期三DNA识别结合域：

锌指（zincfinger）结构

A．Cys2／His2锌指结构；

B．折叠的Cys2／His2锌指结构；C．Cys2／Cys2锌指结构第29页，共50页，2023年，2月20日，星期三同源结构域（homeodomain，HD）同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列。所含的至少二个α螺旋中形成“转折”，第三个α螺旋与DNA大沟相互作用，是同源盒蛋白与DNA结合的主要力量。第30页，共50页，2023年，2月20日，星期三碱性-亮氨酸拉链亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。肽链氨基端20～30个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。DNA结合部位结构域疏水性亲水性亲水性第31页，共50页，2023年，2月20日，星期三螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）

含两个双性α-螺旋，每3～4个氨基酸含一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。第32页，共50页，2023年，2月20日，星期三①酸性α-螺旋（acidicα-helixdomain）能非特异性地与起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用发挥转录活化功能。②富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-richdomain）最强的转录活化域之一。③富含脯氨酸结构域（proline-richdomain）2)转录活化结构域（transcriptionalactivationdomain）第33页，共50页，2023年，2月20日，星期三3.转录水平的调控机制(１)反式作用因子的活性调节

真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。第34页，共50页，2023年，2月20日，星期三反式作用因子的激活方式:①表达式调节②共价修饰

A.磷酸化－去磷酸化。

B.糖基化。③配体结合：(核受体超家族)④蛋白质与蛋白质相互作用第35页，共50页，2023年，2月20日，星期三（2）反式作用因子作用方式

1）成环（looping）2）扭曲(twisting)3）滑动(sliding)4）Oozing

反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？第36页，共50页，2023年，2月20日，星期三（3）反式作用因子的组合式调控基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。第37页，共50页，2023年，2月20日，星期三（1）报道基因分析法原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质粒中,再转染细胞,通过报道基因的活性可检测转录活性。应用：启动子活性的检测常用的报道基因：Luciferase（荧光素酶）、

GFP（绿色荧光蛋白）、

SEAP（分泌性碱性磷酸酶）4.转录水平研究方法第38页，共50页，2023年，2月20日，星期三（2）DNaseⅠ超敏感分析法原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经DNaseⅠ消化常出现长短不均一的100－200bp的DNA片段，说明此DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseⅠ高敏感点(hypersensitivesite)。方法：用DNaseⅠ处理细胞核DNA，再用合适的内切酶进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行southern杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。第39页，共50页，2023年，2月20日，星期三（3）足纹法（footprinting)原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻止核酸酶对其的降解。方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用DNaseⅠ进行切割，电泳，分析图谱。应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。第40页，共50页，2023年，2月20日，星期三（4）凝胶迁移率（gelshiftassay)

或电泳迁移率实验（EMSA）

原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率会发生改变，DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射自显影。

应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

第41页，共50页，2023年，2月20日，星期三(三)转录后水平的调控1.5ˊ端加帽和3ˊ端多聚腺苷酸化及意义

5ˊ端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后，在5ˊ端加上7－甲基鸟苷(m7GPPPmNp-)。

意义:保护转录体mRNA不受5ˊ外切酶降解，增强mRNA稳定性，有利于mRNA从细胞核向胞质转运，促进mRNA与核糖体结合（通过帽结合蛋白介导完成）。第42页，共50页，2023年，2月20日，星期三

3ˊ端加尾:转录后在mRNA在3ˊ末端加上50～150个腺苷酸，即poly(A)尾。意义:保证mRNA在转录过程中不被降解。第43页，共50页，2023年，2月20日，星期三2.mRNA前体的选择性剪接(alternativesplicing)对基因表达的调控作用

（1）mRNA前体的剪接真核细胞基因表达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的mRNA，这一过程即为剪接。

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