叶绿素的提取和分离

叶绿素的提取和分别一、试验过程1、提取绿色叶片中的色素将除去叶柄和粗叶脉的5g左右新奇绿色叶片（菠菜叶或白菜叶、女贞叶），剪碎，放在研钵中，加入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨，当研磨成糊状时，再加入5-6ml丙酮，用杵棒快速搅动后，静止3-5min,就可看到丙酮提取液为深绿色，再将澄清的提取液直接收集到有色的小广口瓶中（不经过滤X丙酮具有肯定的毒性并且很简单挥发。在进行试验操作时尽量少吸入丙酮，搅动后静止时，用纸或塑料薄膜盖在研钵上。由于叶绿体中的各种色素都是脂类化合物，不溶于水，只溶于酒精、乙烷、丙酮、石油醛等有机溶剂中，且用丙酮的效果较好，加入丙酮就是为了快速提取色素。又因丙酮的化学性质不稳定,极易挥发，所以必需在充分的研磨后加入，而不在研磨前或研磨中加入。在试验过程中，发觉在研钵中加入2ml丙酮，数量不足，色素提取液量不多，假如再经脱脂棉过滤，滤液几乎全被吸走，提取色素困难，所以改成加入丙酮5-6ml。将色素收集到有色的小广口瓶中，目的是避开叶绿体中的色素，在接触空气或光照下遭到破坏。2、制备滤纸条取一张预先干燥处理过的定性滤纸,将滤纸剪成8-9cm长，1cm宽的滤纸条，再将滤纸条的一端对折剪去两角。3、画滤液细线用牙签（或用钢笔尖、六号注射针头等）代替毛细吸管，蘸取有色小广口瓶中滤液，沿铅笔线处当心匀称地划出一条滤液细线，划的线条越细越齐（直），而且待滤液干燥后，连续重复画4~5遍，试验效果越好。4、叶绿体中的色素分别将4ml层析液倒入100ml烧杯中，再将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微倾斜靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培育皿盖盖上烧杯，滤纸上的滤液细线要与层析液离开肯定的距离，即层析液不能没及滤纸条上的滤液细线。5、试验结果的观看层析几分钟以后（约4~5min）,滤纸条上便清晰地呈现出四条色素带，从上而下依次是胡萝卜素（橙黄色），叶黄素（黄色），叶绿素a（蓝绿色），叶绿素b（黄绿色X取出滤纸条，待滤纸条稍干燥后，随堂观看试验结果，或待滤纸条完全干燥后，粘贴在试验册的报告栏上，避光保存。（注：为了加速干燥，可以用嘴对着滤纸条轻轻地吹，但不能放在阳光下晒。）三、试验失误的常见缘由及对策1、滤液过稀：提取色素液操作时，方法欠妥，滤液黄绿色，浓度稀，试验效果欠佳,只有深绿透亮的滤液，才能达到好的分别效果。（1）材料选用不当，有的绿叶材料，不都是效果最优的，不能盲从。宜选老嫩适中且浓绿的叶，如：菠菜、青菜、天竺葵、马铃薯、甘薯的叶。(2)所选叶片剪得不碎，加之研磨不充分。试验操作时，尽可能剪碎叶片，可把几张叶片叠放一起，先剪成丝，再一起横着剪碎，这样省时省力。加入少许SiO2,CaC03且快速充分研磨，研120转左右，使研磨液呈匀浆状为好，这样各种色素才能充分溶解在提取液里(丙酮或无水乙醇)。(3)过滤时，漏斗基部的脱脂棉太多(或"尼龙布"不是单层)。过滤时，使用脱脂棉尽可能少，便于得到深绿色的透亮滤液，能阻拦住叶渣即可。切忌用过滤纸过滤，否则色素被汲取，降低滤液中色素的浓度。(4)加入提取液过多，导致滤液中色素含量低。对策是将稀提取液和新添碎叶放入研钵再研。此法也是上述的补救措施。2、滤液不纯：提取液含有过多的杂质或变质，会严峻影响试验结果。(1)叶片表面含有水珠或叶片内含水量过高，降低提取液对色素的抽提效率，且影响层析。对策是用吸水纸或脱脂棉擦去叶片表面水珠，不用过嫩的叶，必要时加少许脱水剂硫酸钠。(2)加入过多的二氧化硅和碳酸钙，这样既影响过滤，又使滤液中有颗粒物，降低滤液浓度。对策是掌握用量，一般各加0.lg。(SiO2起研磨粉作用，破坏细胞结构。CaCO3与有机酸反应，是叶绿素的爱护剂)。(3)滤液存放时间过长，光线和空气的作用，缓慢的有机反应，将溶解的色素破坏,溶液变为褐色，即叶绿素吓琳环中的镁可被H+或Cu2+所取代。液泡膜裂开流出的鞅酸、草酸等有机酸产生的H+置换了叶绿素中的镁后，可以形成褐色的去镁叶绿素。3.滤液线画得过细：画好滤液线是试验的难点和关键，否则现象不明显。(1)滤液线画得不匀实。原人教版教材上讲越细越齐效果越好，新老教材上都讲画滤液细线，极易产生误导。导致同学画的滤液线过浅，线上色素量太少，其实最关键的是画线后绿色较深。实际操作中，每画一次、用电吹风吹干，可重复几次，便于积累色素成分,力求深、齐、匀，线粗1~2mm,可用医院验血时用来吸血的毛细吸管画。(2)滤液线画得距滤纸剪角端太近，易使色素溶解于层析液中，不能在滤纸条上向上集中，距剪角端l.5cm处画线,层析速度适中，效果最佳。四.同学通过亲试验主动地发觉的问题是：四.同学通过亲试验主动地发觉的问题是：1)葱和红薯叶很难或不能提取到色素，为什么？2)为何有些蔬菜叶片，如生菜和芹菜叶片，明明是绿色的，经研磨后变成了黑色或褐色？3)为什么红扶桑叶片是褐红色的，滤液也是褐红色，但仍能分别出橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色4条色素带？而淡黄色的大白菜不能？4)为什么有些试验结果的第2条色素带清晰，有些不太清晰？同一株植物上不同部位的叶片做出来的试验结果也不一模一样，为什么？老师引导同学通过查阅资料集体争论，对上述问题得出的答案如下:1）红薯叶片和葱叶片由于含有粘液质，色素被粘液质粘聚在一起，因此，提取色素时,色素不被溶解或很难溶解到丙酮中，提取不到色素，所以做不了试验。2）生菜（黄苣）和芹菜一样，在进行色素提取时，都会发生褐变，缘由是这些蔬菜中含有还原糖、氨基酸和蛋白质等成分。还原糖与氨基酸或蛋白质起反应，生成黑蛋白，发生了褐变。所以收集到的滤液，颜色是浅黑色或褐色的。但这些褐变的滤液并不影响叶绿体中的4种色素的提取和分别，仍能形成色素带。黑蛋白在滤液细线四周，不随着层析液在滤纸上集中。3）红扶桑叶片的细胞液中含有较多的花青素，呈褐红色，所以提取色素时，滤液的颜色是褐红色的，但这些滤液中除含有花青素外，还含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素。所以，在色素分别时，叶绿体中的4种色素仍能分别出来，形成正常的色素带，而红色的花育素在滤液细线四周，不随着层析液在滤纸上集中，因此滤液细线四周是红色的。4）淡黄色