DNSAA双向聚酰胺薄膜层析课件

DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析一般性实验-4背景层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析等。叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图按层析过程的机理分类：分配层析:

根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配层析。吸附层析:吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。离子交换层析:

是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异而将物质予以分离的一种方法。凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。层析法分类层析法分类按两相所处的状态分类：流动相有两种状态：液体作为流动相气体作为流动相固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为：液相层析和气相层析流动相固定相液体（液相层析)气体（固相层析）液体液-液层析气-液层析固体液-固层析气-固层析层析法分类名称操作形式适用范围柱层析将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离的目的。柱层析是常用的层析形式，适用于大量样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。薄层层析将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用。按操作形式不同分类：分配层析技术（液-液层析法）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体分配层析技术分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。相关的概念（一）：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数(Kd)。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据Kd=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的浓度，Cm:流动相中的浓度分配层析技术相关的概念（二）：迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。Rf=色斑中心至原点中心的距离溶剂前缘至原点中心的距离亲和层析示意图离子交换层析离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂包括交换树脂和交换纤维素两种。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。原理聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离物质与薄膜形成氢键，而各物质形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。展层溶剂与被分离物质在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。

DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析实验操作DNS-氨基酸的制备（已完成）混合DNS－氨基酸的双向层析点样：在薄膜右下角距两边各0.6cm，直径控制在2～3mm之间，点在无光泽面，可重复点样2-3次；苯－冰醋酸层析：将点好样品的薄膜用回形针固定放入展层剂中，展层剂前缘在距薄膜顶端2mm处即可停止,冷风吹干，紫外灯下观察；甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，放入展层剂中，热风吹干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记（以免损坏薄膜表面）；分析实验结果；将层析后标记好的薄膜以点样点为左下角贴于