蛋白质的提取课件

第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术蛋白质的分离与纯化蛋白质的性质蛋白质分离和纯化蛋白质的分离步骤蛋白质的纯化方法蛋白质含量的测定蛋白质纯度等的测定蛋白质存在于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。一、蛋白质的性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。2、蛋白质的胶体性质蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。3、蛋白质的沉淀作用在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。4、蛋白质的变性蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。5、蛋白质的紫外吸收研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。1．蛋白质的分离步骤血红蛋白提取和分离步骤具体操作步骤（一）（二）（三）（四）1.洗涤红细胞1.1洗涤的目的：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白1.2洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有防止破坏红细胞，使血红蛋白流失（一）样品处理黄色2.血红蛋白的释放原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白3.分离血红蛋白溶液分离过程：红细胞混合液离心管甲苯层脂类物质血红蛋白层破碎物沉淀层高速离心10min滤纸过滤脂类物质沉淀物烧杯分液漏斗★注意事项★（1）生理盐水作用？（3）两次离心的差异？（4）透析袋的作用机理？模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。破碎红细胞；溶解细胞膜释放血红蛋白。前慢后快，前短后长。渗透作用（2）蒸馏水和甲苯的作用？离心沉降法凝胶色谱法萃取法层析法电泳法（三）纯化1.凝胶色谱法

（1）原理：（2）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道.根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法概念：凝胶色谱法纯化蛋白质1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程（四）纯度鉴定—电泳实验四血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳【目的要求】1、掌握电泳技术的一般原理和基本操作过程。2、熟悉血清中蛋白分类以及电泳分离操作。【实验原理】

1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，它们的电泳迁移率不同。V=EQ/(6πrη)M=V/E=Q/(6πrη)V：电泳速度M：迁移率E：电场强度Q：颗粒带电荷量r：球形分子半径η：介质粘度【实验原理】

2.影响电泳的因素：

内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状

外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响蛋白质分子运动速度的因素

决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点血清蛋白参考值等电点分子量（kDa）占总蛋白的百分数(%)清蛋白4.646961~71α1球蛋白5.062003~4α2球蛋白5.063006~10β球蛋白5.1290~1507~11γ球蛋白6.85156~9509~184.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。【实验器材】1.DYY-6C型

双稳定时电泳仪和DYY-Ⅲ型电泳槽2.醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）：1片/人。3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.点样器：载玻片。5.滤纸：公用。6.镊子：一个/组。【实验试剂】1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液1.浸泡将2×8cm醋酸纤维薄膜置于电泳缓冲液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于点样。【实验操作】

2.点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，迎光判断光面与无光泽面。用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，垂直按压于醋纤膜标号一端约1.5-2㎝处(约2～3μl)3.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极滤纸桥上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充满缓冲液；而后电压120V，电流0.4～0.6mA/㎝，通电45分钟。

4.染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡3-5min5.漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次(3-4次)，直至条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。6.记录和分析实验结果

漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。【注意事项】1、点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。2、薄膜的浸润与选择正确膜面是电泳成败的关键之一。3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。4.手尽量不要触及薄膜，用镊子夹取。5、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。垂直点样。6、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。7、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。8、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。【思考题】电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？本堂小结本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化获取红细胞（离心）破碎红细胞，释放血红蛋白从各红细胞的成分中获取血红蛋白（离心）初步纯化血红蛋白（透析）从生物材料中提取某些特定成分背景知识早在古代，人类就已发现芳香气味的植株或花卉能使人神清气爽，将这些植物制成干品后，可当做药物和香料使用。但是，植物香料易挥发，不易储存。欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植物芳香油提取技术的诞生。

16世纪，制备植物芳香油的技术已相当成熟。19世纪，有机化学迅速发展，人们通过分析植物芳香油的化学成分，找到了芳香的根源，进而合成了人造香料。如今，植物芳香油广泛地应用于轻工、化妆品、饮料和食品制造的方面。基础知识动物：植物：微生物：主要来源于麝、灵猫、海狸和抹香鲸等天然香料的来源根、茎、叶、花、果实、种子真菌植物芳香油的物理性质:植物芳香油的化学本质:具有很强的挥发性主要包括萜类化合物及其衍生物植物芳香油的提取方法：植物芳香油选择方法的依据：根据植物原料的特点来决定蒸馏、压榨、萃取提取植物芳香油的常用方法：提取植物芳香油常用方法的原理：水蒸气蒸馏法：水中蒸馏法、水上蒸馏法、水气蒸馏法利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，油水混合物又重新分出油层和水层水中蒸馏适于某些鲜花、破碎果皮和不易粘结的原料。但水中蒸馏精油中的酯类成分易水解，所以含酯类高的香料植物不能采用这种方法。1.水中蒸馏又称隔水蒸馏，是把原料置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定水量以满足蒸馏操作所需的足够的饱和蒸汽，水层高度以水沸腾时不溅湿原料底层为原则。2.水上蒸馏水上蒸馏应用较广，大面积种植的芳香植物为薄荷、香茅、桉树叶等都用水上蒸馏提取精油；此法也适用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。是由外来的锅炉蒸汽直接进行蒸馏。通常在筛板下锅底部位装有一条开小孔的环形管，锅炉来的蒸汽通过小孔直接喷出。通过筛板的筛孔进入原料层加热原料。由锅炉来的蒸汽是具有一定蒸汽压力，温度较高而含湿量又较低的饱和蒸汽，能很快加热料层，因此，对干料加热蒸馏时，干料必须在装锅前预先湿透。直接蒸汽蒸馏，其蒸馏速度快，温度高，可缩短蒸馏时间，高沸点的成分可蒸出，出油率高。3.直接蒸汽蒸馏

因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题原因：提取柑橘芳香油的方法：通常用压榨法萃取法的原理：将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中的方法。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以获得纯净的植物芳香油了。比较项目实验原理方法步骤适用范围水蒸气蒸馏法萃取法压榨法利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发后得到芳香油通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油①水蒸汽蒸馏②分离油层③除水过滤①粉碎、干燥②萃取、过滤③浓缩①石灰水浸泡、漂洗②压榨过滤静置③再次过滤提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油原料颗粒尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取植物芳香油提取三种方法的比较1、提取方法：水蒸气蒸馏法一、玫瑰精油的提取：实验设计2、实验设计玫瑰精油的提取装置：3、实验步骤：

①采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。

②装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。③安装蒸馏装置：所有仪器必须事先干燥，保证无水。④加热蒸馏⑤拆卸蒸馏装置：

⑥分离油层：

蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。

收集锥形瓶中的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1g／mL的NaCl，然后将其倒入分液漏斗中，用分液漏斗将油层和水完全分开。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。⑦除去水分：

向接收瓶加入无水Na2S04，24h后过滤，得到玫瑰油。注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。鲜玫瑰花+清水水蒸气蒸馏油水混合物油水分离除水玫瑰油加无水Na2SO4加NaCl氯化钠：促使油水混合物（乳浊液中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的水分。实验流程示意图：压榨装置通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油实验原理：实验装置：二、橘皮精油的