高春芳-分子诊断助力精准医疗

立大会暨2016分子诊断学术会议立大会暨2016分子诊断学术会议助力精准医疗第二军医大学第三附属医院高春芳2016.11.18分子诊断时代到来了分子诊断时代到来了！ yFCMlecularBiologyPCRe23DNA核酸杂交突变/异常基因检测DNA核酸杂交突变/异常基因检测核酸定性/定量/突变检测杂交芯片ddPCR质谱Sanger测序法焦磷酸测序高通量测序……景分子诊断狭义上是指基于核酸的诊断，即对各种样本DNA和/或RNA的检测以实现对疾病的诊断、个体化用药指导、预后及风险预测等分子诊断新的外延：分子诊断的对象包括基因及其相关的表达产物(生物大分子)4分子诊断是精准医分子诊断是精准医学的核心之一2015年1月20日，奥巴马在国情咨文中提出了“精准医学计划”2015年1月30日白宫发布文件正式启动“精准医学计划”2016年1月12日奥巴马最后咨文中宣布启动美划Amoonshotofcancer12+82011年，美国基因组与生物学界智库提出“精准医学”的概念5分子分子诊断是实现精准医疗计划的重要手段计划“十三展规划2016一系列重实施2015年3月科开了首次医学战略专030年前投入元2015年2月习病原体感染病原体感染6分子诊断发展现状和意义发展最活跃、更新最迅速的医学科学领域之一革命性意义---个体化医疗、精准医疗的关键技术应用涉及范围广：涵盖了遗传性疾病、肿瘤、微肿肿瘤遗遗传代谢优生优生优育7科学协会生物技术协会科学协会生物技术协会传学会……JournalofMolecularExpertReviewofagnosisMolecularDiagnosticsherapy•…《分子诊断学》高等教育出版社2007《临床分子诊断学》人民卫生出版社2013分子诊断学科形成并发展迅速gyAMPratory 8分分子诊断在上海市的发展现状有从事分子诊断的专业实验室精准医学中心分子病理实验室、分子诊断实验室产前分子诊断实验室、遗传内分泌实验室上海市通过验上海市通过验收的临床基因扩增实验室有110+家试点单位无创产前诊断试点单位有新华医院、仁济医院、国妇婴、一妇婴等4家肿瘤基因测序试点单位有肿瘤医院、中山医院、瑞金医院、长海医院、东方肝胆医院等5家遗传病诊断试点单位有儿童医院、儿科医院2家9精精准医疗意义深远基于包括分子实验医学基于包括分子实验医学、组学大数据等在内的医学科技与现代信息技术在临床诊治及疾病预防中的应用给临床诊治模式到来了深刻给临床诊治模式到来了深刻变化并引发新一轮医疗变革医学科技医学科技助推生物医药、医疗器械成为战略性新兴产业治未病治已病治末病治未病治已病治末病为，并主要医理想精准医疗与健康管理reusuallyhelpalwayscomfort血液循环肿瘤细胞CTC来源：肿瘤的凋亡、滑丝和分泌作用：在肿瘤诊断、寻找靶点、疗效与耐药检测血液循环肿瘤细胞CTC来源：肿瘤的凋亡、滑丝和分泌作用：在肿瘤诊断、寻找靶点、疗效与耐药检测、预后评估以及评估肿瘤异质性、肿瘤动态变化等me精准医疗---分子肿瘤领域种种类：有/无转移潜能/EMT特性/干细胞特性应用：CTC或者模型成活细胞计数预测预后、研究新药研发靶点、PDX模型药物筛选及机制研究外外泌体包含miRNA、蛋白质等物质，是肿瘤微环境的重要承载体调节肿瘤进展、血管形成、转移和免疫逃逸等CTCCTC国内发展令人鼓舞!为主要识别载体定标志物、多重原位PCR识别分分离纯化及检测阴性富集法、阴性+阳性双富集法；纳米颗粒或者纳米滤膜截留；光、微流控技术/微流控鞘流特点及优势特点及优势捕获效率提高、通量高(4-8通道)，速度快(最快的2.5小时完成分析)需要样本量小 (最少的仅需2ML血样)、可对接下游单细胞分子(培养扩增、单细胞测序、Fish\PCR、药敏等)、基本实现国产化血液循环中携带有包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常血液循环中携带有包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等来自肿瘤基因组DNA的片段，含量低，约占整个循环DNA的1%甚至只有001%通常通常160-180bp,这个长度差不多是核小体缠绕的DNA长度加链接片段长度。用于肿瘤早期诊断、用药和监测孕妇孕妇cfDNA，部分来自于胎儿，占整个10-15%cfDNA，可用于无创新产前诊断判断肿瘤原发部位A的肿瘤驱动基因转录状态，预测肿瘤个体原发病灶的基因表达情况27日，卫计委发布了国卫办妇幼发[2016]45号文27日，卫计委发布了国卫办妇幼发[2016]45号文生委办公厅关于规范有序开展孕妇外周血DNA展无创产前面规范运行精准医疗---药物基因组学精准医疗---药物基因组学------MS---靶点靶向药疾病ALKCertinib(赛立替尼)肺癌Alectinib(艾乐替尼)Crizotinib(克唑替尼)EGFR(HER1/ERBB1)Gefitinib(吉非替尼)肺癌Eriotinib(厄洛替尼)Osimertinib(奥斯替尼AZD9291)Necitumumab(耐昔妥珠单抗)Afatinib(阿法替尼)Lapatinib(拉帕替尼)乳腺癌Cetuximab(西妥昔抗体)结直肠癌、头颈癌Panitumumab(帕尼单抗)结直肠癌、肾癌HER2Afatinib(阿法替尼)肺癌HER2(ERBB2/neu)Ado-trastuzumabemtanisine(T-DM1)乳腺癌Pertuzumab(帕妥珠单抗)Lapatinib(拉帕替尼)Trastuzumab(曲妥珠单抗)乳腺癌、胃癌、食管胃结合部癌KIT,VEGFRPDGFR,RAFSorafenib(索拉非尼)METCrizotinib(克唑替尼)肺癌mTOREverolimus(依维莫司)乳腺癌、肾癌Temsirolimus(替西罗莫司)肾癌20药PD-1mabtinibAlectinib(艾乐替尼)zotinib是nib是tinibAZDmabAfatinib阿法替尼)Afatinib阿法替尼)zotinib是PD-1zotinib是VEGFb是VEGFR2ab2122肝癌、结直肠癌靶向药物22药Sorafenib(索拉非尼)是uximab是Zivaflibercept替)VEGFb是Zivaflibercept替)VEGFR2ab药是rastuzumabab是us是b是VEGFR2ab2324CD19Blinatumomab血病CD20Obinutuzumab(奥滨尤妥珠单抗)白血病、淋巴瘤Ofatumumab(奥法木单抗)血病Rituximab(利妥昔单抗)白血病、淋巴瘤Ibritumomabtiuxetan(替伊莫单抗)淋巴瘤Tositumomab(托西莫单抗)CD3Blinatumomab血病CD30Brentuximabvedotin(本妥昔单抗)淋巴瘤CD38Daratumumab(达雷木单抗)多发性骨髓瘤CD52Alemtuzumab(阿伦单抗)血病Idelalisib淋巴瘤CDK4Palbociclib(帕博西尼)乳腺癌CDK6Palbociclib(帕博西尼)乳腺癌CTLA-4Ipilimumab(易普利姆玛)黑色素瘤25药药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)神经精神类等多种药物的用药指导26引自药物代谢26引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较AS-PCR灵敏度高，适于对肿瘤组织中突变比例较低的体细胞突变进行检测通量低对小样本、低突变比例的体细胞突变进行检测实时荧光PCR通量较高，操作简单仪器设备易普及探针较昂贵对相同位点、大样本标本进行检测，可用于mRNA表达检测PCR-RFLP无需特殊的仪器设备，成本较低，实验过程简单可操作性强通量低，只适用于部分SNP分型适用于无条件够买贵重仪器设备的实验室开展小样本的分型检测M成本低，灵敏度高，闭管操作，降低污染风险需要特殊仪器设备，程较为适合有该类机器的实验室开展各种类型SNP分型研究；可用于已知甲基化位点的检测27引自药物代谢27引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较Sanger法测序直接获取序列，分型的金标准，未知突变通量低，不能检测突变比例小于20％的SNP各种SNP的检测，未知突变的筛查以及验证其他分型的结果焦磷酸测序高通量，高灵敏度，可以检测插入/缺失突变和未知突变。等位基因含量的比例可用于室内质控需要特殊仪器设备适合于较大样本、突变比例高于5％的各种类型SNP检测甲基化位点的确定基因芯片法通量高灵活度低，成本高，需要特殊的仪器设备适用于具备芯片检测能力的实验室对已知固定位点、大样本标本进行检测原位杂交 (ISH)在细胞核原位对基因的异常进行检测成本高，通量低时间较长适于对基因扩增和缺失异常进行检测28引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)28引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导1ALDH2*2携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油舌CYPCVKORC基因型代入华法林剂量计算公式计算初始用药剂量；减少携带CYP2C9*3的个体塞来昔布的用药剂量；适当增加携带CYP2C9*3等位基因的高药剂量。增加PM基因型个体氯吡格雷的剂量，或选用其他不经CYP2C19代谢的抗血小板药物如替格瑞洛等；PM基因型个体阿米替林的起始剂量降低至常规剂量的50％并严密监测血药浓度；PM基因型患者应用伏立康唑时容易出现毒副反应，建议适当减携带CYP2D6*10等位基因的患者他莫昔芬的疗效欠佳，阿米替林的起始剂量应降减少CYP3A5*3/*3基因型患者他克莫司的用药剂量，以避免发生不良反应。可将CYP3A5*3基因型代入公式计算他克莫司的起始剂量。降低CYP4F2*3纯合子基因型患者华法林及香豆素类抗凝药(醋硝香豆素、苯丙香2929药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导2测携带DPYD*2A等位基因的患者应慎用5-FU、卡培他滨和替加氟，或降低用药NAT1和NAT2慢代谢型基因型患者反复给予异烟肼后易出现蓄积中毒，引起周OBTC携带521C等位基因的患者慎用辛伐他汀和西立伐他汀，以降低发生肌病的风险，FDA表2)。MT降低低酶活性基因型患者MP的用药剂量，杂合子起始剂量为常规剂量的30~70％，携带两个突变等位基因的个体用药剂量为常规用药剂量的1/10，或1周3次给予常规剂量的药物，或换用其他药物，以避免产生严重的造血系统毒性反应；TPMT活性极高基因型的患者MP治疗可能无效。携带TPMT突变等位基因UGT1A1*28(6/7)和(7/7)基因型个体应用伊立替康时应选用剂量较低的化方案，以避免引起严重腹泻；携带UGT1A1*6等位基因的患者4级中性粒细胞险增加，应谨慎使用。引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)0药物代谢酶和药物作用靶药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导3项目ACEI/D多态性DD基因型的高血压患者建议选用福辛普利进行降压治疗；DD基因型的高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者建议使用依那普利和赖诺普II利治疗时应注意监测肾功能。ADRB1多态性检测Gly389基因型高血压患者建议不选用美托洛尔降压，或适当增加用药剂量。APOE多态性检测基因型为E2/E2的高血脂症患者建议选用普伐他汀治疗，以提高降脂疗效。ANKK1rs1800497携带rs1800497A等位基因的患者应用第二代抗精神病药时静坐不能不良(dMMR)检测dMMR接受不含5-FU的化疗方案。突变等位基因的G6PD缺乏患者禁用氯喹、氨苯砜和拉布立酶。引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)1项目项目携带HLA-B*1502等位基因者慎用卡马西平和苯妥英，携带HLA-B*5801等位基因者慎用别嘌呤醇，以免引起SJS/TEN；携带HLA-B*5701等位基因性肝损害。韦林治疗HCV感染的疗效差。(MSI)检测MSIHFUPMLRARAPLAsO进行治疗。TOP2A基因异常(基因扩检测TOP2A基因异常的乳腺癌患者建议采用含蒽环类药物的治疗方案。VKORC-1639G>A携带-1639A等位基因的个体应减少华法林的用药剂量，具体可根据华法林始用药剂量。建议ERCC1mRNA低表达的非小细胞肺癌患者选用以铂类为主的化疗方RRMmRNA低表达的患者选用吉西他滨为主的化疗方案。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导4引自药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)2学中的应用微流控技术……3个体遗传背景外因个体遗传背景外因个体免疫状态个体化分子诊断研究和应用高通量测序研究HBV基因变异以肝癌为代表的肿瘤性疾病糖组学标志物研究病病原体HBV-肝病环环境饮食等45四“多”应用基因体DNA修复合成基因6基因因7个位点病患、进展第第三/四轮筛选验证 (肝癌)早期诊断，随访复发4个基因6个位点临床应用实实验性干预研究2个基因4个位点肝癌相关基因之一肝癌相关基因之一TGFβ1SNP与肝硬化进展相关基因变异与外周血蛋白水平有关CytokineCytokine;43(1):20-25TGFβ1-509C>T变异与肝癌发生rImmnunolImmunolther2009;58(9):1443-144037肝癌相关基因之二肝癌相关基因之二CRHRCRHR2SNP与肝癌发生相关HumanHumanGenetics127(1):75-81withHBVinfectionOddsratioT583(0.80)enotype0.0091.61(1.13-2.31)*0.0031.88(1.24-2.86)*65)COL1A1SNP与肝硬化发生相关 特定单倍型与肝硬化发生密切相关DigDigDisSci2):369-37689HumanHumanImmunology2010;71(1):83-7相关基因之三/四hdd(95%CI)eefAGef CTLASNP男性肝癌发生相关PHumanHumanImmunology2010;71:621-640TGFTGF-509C>T具有不同转录调控活性CytokineCytokine;43(1):20-2541更高mRNA及蛋白表达水平 0.20CCCTTT86420CCCTTTCancerCancerImmnunolImmunolther2009;58(9):1443-144042APC表面标志DigDigDisSci201257(11):2901OnOngoingstudiesofSNPs队列的持续随访重点基因/位点的前瞻性验证依据最新进展(GWAS等)补充新的SNP位点功能研究(诠释)令HumGenet2010令HumGenet2010Jan;127(1):75-81令HumImmunol2010Jun;71(6):621-6*令CancerImmunolImmunother2009;58(9):1433-1440令MolBiolRep2012;39:797-803.令PLoSOne2011;6(12):e28486令HumImmunol2010Jan;71(1):83-7令IntJColorectalDis2010Jan;25(1):39-45.令Colorectaldisease2010;12(11):1153-8令Pathology2009;41(6):555-560令DigDisSci2009;54(2):369-76令Cytokine2008Jul;43(1):20-5.令BMJOpen2012,2(2):e0008254344HBV突变1.用于抗HBV核苷(酸)类似物耐药突变位点及基因型定量研究和应用(已转化)2.原发性肝癌高危变异位点研究用于临床肝硬化/肝癌预测和预后监测3.HBV变异与临床乙肝标志物及cccDNA的相关研究用于临床检测结果的正确诠释45代测序---HBV全基因组测序eAminoacidnrequencydyfirstantuhoryearCountryMutationfrequency(n)OR(95%CI)ofHCCceXgene/CP/EnhⅡTAS105T99(99/100)Kim,2009(47)Korean12.4(12/97)3.082(1.148-8.276)Xgene/BCPA2T/G1764A88(88/100)Liu,2009(68)Meta-Analysis71(1566/2217)3.79(2.71-5.29)Xgene/BCPV131I87(88/101)Liu,2011(39)China-2.9(1.7-4.9)Xgene/BCPK130M8686(87/101)Liu9)-3.1-8.2)74(75/101)Cho,2010(57)Korean22.5(18/80)3.484(1.146-10.593)73(68/93)Yin,2010(26)China57.27.15(2.85-17.92)eCPWW28Stop5858(57/99)Liu,2009(68)Meta-Analysis-1.15(0.83-1.74)HRQ55(54/98)Cho,2010(57)Korean51.25(41/80)2.627(1.283-5.382)Xgene54(51/95)Choi,2009(30)Korean38.1(16/42)A90V48(42/101)Yin,2010(26)China663.76(2.19-6.46)neI97L36(35/96)Zhu,2010(38)China40(8/20)3.99(1.61-9.92)Xgene/BCPITN/S35(35/101)Liu,2009(68)Meta-Analysis39(317/812)2.35(1.63-3.40)neS87G31(30/97)Zhu,2010(38)China25(5/20)2.01(1.09-3.68)Xgene(intheboxgion28(29/102)Liu,2009(68)Meta-Analysis37(257/695)2.76(2.09-3.64)N39K22(20/92)Yin,2010(26)China45.525.65(9.64-68.22)A39V21(20/95)Liu,2011(39)China14.80.2(0.1-0.5)NN39D2121(19/92)Liu,2011(39)China78.533.4(12.3-90.3)A62G/C2964A21(19/92)----Xgene/BCPTA5(5/102)Guo,2008(56)China19.0(11/58)3.089(1.007-9.481)Xgene/BCP4(4/101)Guo,2008(56)China22.4(13/58)2.641(0.98-7.14)ne0(0/97)Zhu,2010(38)China30(6/20)9.70(1.17-80.58)46高通量测序在HBV耐药突变检测中的临床应用47提取提取Q-PCRHBVRT区NGS测序过程高通量测序第一次PCR富集片段，每个片段加上独特的Barcode，并构建文库第二次PCR，每个文库加上IndexReads不足500的样本数据分析过程形成pipeline，进行流程化分析方法比较交基因型位点基因型位点和频率(%)基因型(%)1513.31WTCTCT1573.78WTCTCT130180M4.61204V180MC204VCV9.28)156GCVI2/1.53)G2.9)C)9181T6.40250LCTCTC46.83204VC204204IC)CCC06.91204I7CTCTC二代测序与一代测二代测序与一代测序结果符合率高，并可检出低频突变位点49组别样本均数SD批内CV(%)批间CV(%)高突变组198.950.2550.258230.1740.565中突变组4518.532.2111.9523.5076780.1913.363质控质控体系混合样品编号QC1QC2L180MM204I混合百分比(%)混合百分比(%)QC1023.225.3level1802031.636.5level2604040.047.7level3406048.458.8level4208056.870.0QC2067.486.1L180M(%)M204I(%)样品编号预预期突变率(%)测序结果平均突变率(%)预期突变率(%)测序结果平均突变率(%)QC123.226.025.322.7level131.631.630.836.532.3level240.041.347.748.1level3448.448.158.858.6level456.856.170.067.3QC26767.465.986.182.1报告样单报告样单(多分子合作平台)东方肝胆医院HBV多耐药位点检测东方肝胆医院HBV多耐药位点检测dtype1.5%Dtype3%B/CA/C住院患者病种分布113%LC82%HCC 序列特征分析在宏基因组学中的应用kmer列来源分类BMCGenomics53BVpreSCHBHCCHBVpreS区序列存在显著差异HCCB/C型病毒PreS区缺失比较有显著差异利用preS区缺失特征训练SVM模型可HCCVcccDNA肝病进展及多耐药变异的个体化研究HBVHBVcccDNA量对肝癌进展影响的个体化研究PlosOne2014;ClinExpMed.201557%50~60%小肝癌70~86%14~20%0%50~60%小肝癌70~86%14~20%0~2%慢性乙肝肝硬化肝癌基于N糖组的肝癌新标志物研究 lperprotein lperproteinsRNAProteinionPTM5-50functionallinksPhosphorylation,Acetylation,tionfinjuryHBV肝病五年病死率HCCvsfibrosisHCCearlyvslatenducedHCCvsfibrosisHCCearlyvslatenducedHCCratmodel1120cases128cases145casesfibrosisfibrosiscirrhosistumorfibrosisancerautocrineautocrineCCKCCK-8HCCcellssecretIgGIgGfromHCCserastimulatesproliferationofHCCcellsinvitrocostainingIgG+LCAcostainingIgG+LCALCAblotCIgG-L3(%)isincreasedinHCCFuc-IgG/IgG=IgG-L3IgG-L3%hasbetterHCCdiagnosticefficaciesthanAFPYiCH,...GaoCF.Oncoimmunology201561sMay1N-糖标志物在原发性肝癌早期诊断、动态监测疗效评价中具有重要应用价值rDisDiagnostics:1.PLoSOne.Diagnostics:1.PLoSOne.20162.Oncotarget.20153.MedOncol.20154.ClinSci(Lond).20155.IntJCancer.20156.ClinExpMed.20157.PLoSOne.20148.ClinChimActa20149.CancerSci.201310.ClinChimActa.201311.