不同酒精度白酒对 Hepg2细胞相关蛋白的影响

不同酒精度白酒对Hepg2细胞相关蛋白的影响摘要Hepg2细胞来源于人体的肝癌组织，Hepg2细胞中存在着众多与细胞生命活动息息相关的蛋白质，这些蛋白质的功能对于Hepg2细胞来说极其重要的意义，同时目前国内对于这方面的相关研究基本上处于空白期。目的：探究不同酒精度白酒对Hepg2细胞内的相关蛋白的影响。方法：设定不同的时间梯度去探究对细胞活力、总蛋白质含量、膜脂氧化程度（MDA）、过氧化氢酶活力、钙调蛋白含量以及Caspase-8凋亡蛋白酶活性的影响，以维生素C和维生素C二甲酸胍做为阴性对照组和阳性对照组，以生理盐水作为空白对照组，以35%白酒、40%白酒、45%白酒、52%白酒、56%白酒实验对照组染毒Hepg2细胞作为实验处理组。关键词：白酒、Hepg2细胞、蛋白质ABSTRACTHepG2

cells

are

derived

from

human

liver

cancer

tissue.

There

are

many

proteins

that

are

closely

related

to

cell

life

activities

in

HepG2

cells,

and

the

function

of

these

proteins

is

of

great

significance

to

HepG2

cells.

At

the

same

time,

the

relevant

research

in

this

field

in

China

is

basically

in

a

blank

period.Objective:

To

explore

the

effects

of

different

alcoholic

liquors

on

related

proteins

in

HepG2

cells.Methods:

Different

time

gradients

were

set

to

explore

the

effects

on

cell

viability,

total

protein

content,

degree

of

membrane

lipid

oxidation

(MDA),

catalase

activity,

calmodulin

content

and

caspase-8

apoptotic

protease

activity.

Guanidine

formate

and

vitamin

C

were

used

as

negative

control

groupand

positive

control

group,

and

normal

saline

was

used

as

blank

control

group.

The

HepG2

cells

infected

with

35%,

40%,45%,

52%

and

56%

liquor

experimental

control

groups

were

usedas

experimental

treatment

groups.Key

words:

liquor、HepG2

cells、protein目录摘要ABSTRACT1.绪论2.材料与方法3.结果与分析4.结论与讨论参考文献致谢1绪论1.1研究目的：通过本次实验去探索不同酒精度白酒对Hepg2细胞内的相关蛋白的影响。1.2研究意义：Hepg2细胞中存在着众多与细胞生命活动息息相关的蛋白质，这些蛋白质的功能对于细胞来说极其重要。本实验就是为了探究不同酒精度白酒对病人Hepg2细胞的相关蛋白影响。1.3研究背景：原发性肝癌是我们生活中一种常见的恶性肿瘤，对人体的危害性极大，其发病率居于肿瘤发病率的第六位，而病死率仅次于肺癌，我国肝癌患者占全球肝癌患者总数的一半以上，死亡率也居高不下。在目前已确定诱发肝癌的因素中，酒精是其中之一[2]。中国是闻名世界的文明古国，是白酒的发源地。在中华民族的五千年历史长河之中，酒和酒文化一直具有非常重要的地位。酒文化作为一种特殊的文化形式，在传统的中国文化中有着其独特的地位。在中华民族几千年的文明史中，酒几乎渗透到了我们社会生活中的各个领域。酒，在中国文化的历史长河中，已不仅仅是一种客观的物质存在，而是一种文化象征，即酒神精神的象征。所以白酒目前基本上已经成为中国人民饭桌上必不可少的一样东西。在我们人体的几大脏器之中，肝脏是乙醇代谢的主要器官，长期过量饮酒严重损伤肝脏，导致脂肪肝、肝硬化，明显增加肝癌的罹患率[2]。1.4研究现状：目前关于这个方面的研究较少，已经完成的研究方向为:乙醇促进HepG2细胞表达、分泌VASN蛋白及对HUVEC细胞迁移的影响。VASN蛋白是一种典型的Ⅰ型跨膜蛋白，包含串联的亮氨酸结构域，类表皮生长因子结构域和纤联蛋白Ⅲ结构域，其可以被金属蛋白酶ADAM17剪切，从细胞膜上脱落分泌至细胞外，产生可溶性VASN蛋白（sVASN）。人VASN蛋白主要表达于主动脉的血管平滑肌细胞、肾脏、胎盘组织等，其它组织中表达水平低。乙醇刺激不同时间（24、48、72h）后，提取细胞总RNA，qPCR检测发现三种浓度乙醇刺激均可导致VASN蛋白的mRNA水平显著上升；细胞总蛋白WesternBlot结果显示，三种浓度乙醇均促进VASN蛋白表达[2]。2.材料与方法2.1实验仪器：超净工作台、冰箱、超低温冷冻箱、常温摇床、分析天平、高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、超声波破碎仪、离心机、高速冷冻离心机、酶标仪、荧光显微镜、荧光光度计、CO2培养箱，37℃水浴锅2.2实验器材:细胞培养瓶、细胞培养板、马氏管、10μL移液枪、20μL移液枪、200μL移液枪、1000μL移液枪、移液枪枪头、容量瓶、烧瓶、量筒、玻璃棒、酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅、无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔2.3实验药品：苯巴比妥酸（householdorotherus）、磷酸二氢钾（成都市新都区木兰镇工业开发区）、三氯乙酸（成都市科龙化工试剂厂）、磷酸二氢钠（成都市科龙化工试剂厂）、氢氧化钠（成都市科龙化工试剂厂）氯化钾（成都市科龙化工试剂厂）、氯化钠（成都市科龙化工试剂厂）、磷酸二氢钾（成都市科龙化工试剂厂）、磷酸（成都市科龙化工试剂厂）、二甲亚砜（成都市科龙化工试剂厂）、MTT、DEAM高糖培养基（吉诺生物医药技术有限公司）、考马斯亮蓝G-250（武汉科瑞生物技术有限公司）、胎牛血清（浙江杭天生物科技股份有限公司）、双抗（吉诺生物医药技术有限公司）、钙离子荧光探针（碧云天生物技术）、Caspase-8活性测定试剂盒、维生素C、35%白酒、40%白酒、45%白酒、52%白酒、56%白酒、无水乙醇。2.4大型仪器高速冷冻离心机荧光显微镜酶标仪荧光光度计2.5试剂配制方法：（1）PBS配方NaCl4gKCl0.1gNa2HPO40.72gKH2PO40.12g调PH至7.4，用去离子水定容至500ml（2）MTT配方（5mg/ml）取0.05gMTT溶于10mlPBS中（3）HBSS缓冲液配方NaCl4gKCl0.2g葡萄糖0.5gKH2PO40.03gNa2HPO40.024g调PH至7.2，定容至500ml,4℃保存（4）考马斯亮兰G—250染料试剂考马斯亮兰G—25050mg95%乙醇25ml85%磷酸50ml加去离子水定容至500ml，装入棕色试剂瓶中，并用锡箔纸包裹，避光保存（5）0.6%TBA溶液TBA0.6g1mol/L的NaOH2ml溶解于10%的三氯乙酸，去离子水定容至100ml,如果TBA未完全溶解，可用水浴锅加热（小于65℃），直至TBA完全溶解为止。2.6细胞培养板各物质的添加量DEAM高糖培养基2ml胎牛血清60ul双抗10ul细胞液200ul白酒、生理盐水或维生素C200μL2.7细胞冻存、复苏和传代2.7.1实验原理：细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用低温冻存技术，把细胞置于-80℃冰箱中进行低温保存，可以让细胞暂时脱离生长状态，从而将细胞的特性完整保存起来，这样可以在需要的时候再复苏细胞用于实验过程。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

如果不加任何保护条件下就直接冻存细胞，细胞内环境和外环境中的水会形成冰晶，会导致细胞发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，会引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－80℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。2.7.2实验方法细胞复苏1.准备无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔2.步骤（1）穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从-80℃冰箱里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。（2）解冻后可用纸巾擦去冻存管表面的水滴，然后用酒精喷壶喷洒75%酒精对冻存管封口处进行消毒。（3）打开超净工作台，紫外灭菌30min,实验开始之前，需点燃酒精灯，冻存管放超净台，先更换新手套，然后小心打开冻存管，以避免污染。（4）用灭菌后的移液枪取1ml细胞加入细胞培养瓶中，再加入新鲜配制的含10%血清的培养基8.5ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至细胞培养瓶中。（5）平躺放置培养瓶，加入胎牛血清300μL以及双抗50μL，置于37℃，5%CO2培养箱培养。传代（1）复苏后的细胞用CO2培养箱培养培养24小时，用荧光显微镜观察细胞，当细胞贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记好时间（2）细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。（3）加入1mlPBS，小心润洗细胞，重复3次操作，弃PBS。（4）加入8.5ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。（5）转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至8.5ml。（6）小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。（7）待长满后，按同样的方法传代培养。冻存当不需要使用细胞或者细胞量足够时，可以将细胞冻存起来，供以后实验用（1）准备细胞冻存液（20%血清、10%DMSO、70%基础培养液）步骤1.选取活力好，密度约70%细胞用于冻存，此时细胞处于对数生长期，最适合用于冻存。2.细胞吹打或者胰酶消化后，转移至无菌EP管，1000rpm里面5min。3.弃上清，加入新鲜配制的细胞冻存液，加入2ml细胞冻存液，分装2个冻存管，。4.做好标记，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（-20℃，30分钟）→超低温冰箱（－80℃保存）。2.8实验原理2.8.1细胞活力测定：实验原理：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）或三联溶液（SDS和酸化异丙醇）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm/570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等[9]。2.8.2总蛋白质含量测定考马斯亮兰法原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比[4]。2.8.3膜脂过氧化测定MDA实验原理：当动植物细胞发生衰老或在不适合生长的逆境中受到伤害时，往往发生细胞膜上的膜脂过氧化作用,膜脂过氧化作用的产物比较复杂，包括一些醛类、烃类等。丙二醛(malondialdehyde,

MDA)是其产物之一,其从膜上释放出来后，能够和蛋白质、核酸等生物大分子交联或反应，改变其结构和功能，还可以使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质合成等，故通常用它作为膜脂过氧化指标,表示细胞膜脂过氧化程度。在酸性和高温度条件下，MDA可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm[4]。2.8.4过氧化氢酶活力测定过氧化氢酶（CAT），是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH。过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。测定原理：过氧化氢酶（Catalase）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。2.8.5钙调蛋白含量测定钙调蛋白（calmodulin,CaM）又称钙调素，是一种普遍存在于各种真核细胞内，并能与钙离子结合的多功能蛋白质。钙调蛋白参与细胞内多种信号转导途径，并在Ca2+依赖性信号转导途径中起到关键作用，是动态Ca2+传感器，能够响应广泛的Ca2+浓度，并向下游传递信号。测定原理：荧光指示剂测定荧光指示剂测定法是用具有特异性与细胞内游离钙离子结合的荧光探针或染料，以其与钙离子结合后荧光强度大小测定细胞内钙离子含量的一种方法，钙调蛋白含量与钙离子含量大小成正比，所以可以通过测定钙离子含量来间接测定钙调蛋白含量，即以钙离子含量的来间接表示钙调蛋白的含量[15]。2.8.6Caspase-8活性测定Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)。caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节，包含10多个成员。Caspase-8也称FLICE、MACH或Mch5，通常以酶原的形式存在，凋亡时被激活，被认为是细胞凋亡转导过程的上游Caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的凋亡过程中Caspase-8被激活形成二聚体，进而激活下游Caspase-4,6,9,10[5～6]。实验原理：测定原理基于Caspase-8特异水解多肽底物Ile-Glu-Asp-p-nitroanilide,释放的游离硝基苯胺pNA在405nm有最大吸光度。采用酶标仪测定pNA在405nm处的OD值而得到Caspase活性[5～6]。3结果与分析3.1细胞形态观察（1）打开荧光显微镜；（2）从CO2培养箱取出细胞培养瓶，用75%酒精喷壶进行灭菌；（3）将细胞培养瓶置于载物台上；（4）调节粗准基螺旋和细准焦螺旋，找到Hepg2细胞的位置，并进行观察；3.2不同酒精度白酒对Hepg2细胞活力的影响3.2.1本实验通过MTT实验来进行Hepg2细胞活力的测定实验步骤：（1）取35%白酒、40%白酒、45%白酒、52%白酒、56%白酒、生理盐水、维生素C各200ul分别加入细胞培养板中，然后每个培养板个加入DEAM高糖培养基2ml、胎牛血清60ul、双抗10ul、细胞液200ul，每个浓度梯度分别做3个平行组，置于CO2培养箱中，分别培养24h、48h、72h；（2）染毒完成后，将细胞培养板从CO2培养箱中取出，用移液枪小心吹打细胞培养板底部，使贴壁细胞从细胞培养板中脱落，轻微振荡混匀，然后从每个细胞培养板取体积200ul细胞培养液，接种到96孔板.（3）呈色：每孔加MTT溶液10ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加100ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。（4）：比色：选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，以DEAM高糖培养基作为空白对照组，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞活力曲线。实验结果48h白酒浓度OD值平均值35%0.5650.5880.5740.57640%0.3120.2840.02960.20945%0.2440.2560.2480.24952%0.5030.510.4910.50156%0.3540.3580.3490.354生理盐水0.4240.4340.4280.429维生素C0.4760.4640.4820.47472h白酒浓度OD值平均值35%0.5650.5840.5760.57540%0.5220.5340.5460.53445%0.2440.2360.2480.24352%0.3010.3080.3110.30756%0.3200.3080.3140.314生理盐水0.3510.3440.3360.344维生素C0.4100.4420.4370.4303.3测定不同酒精度白酒对Hepg2细胞内总蛋白质的影响3.3.1标准曲线的测定试剂：（1）标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：取考马斯亮蓝G-250，50mg，加95%乙醇25ml，85%磷酸50ml溶解，加去离子水定容至500mL于棕色瓶保存，染液可保存数月。3.3.2器材：①酶标仪②旋涡混合器③10.0mlEP管77支3.3.3操作方法取22支10.0mlEP管，1支作空白，其余21支10.0EP管分为7组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用去离子水补充到0.1ml，每支实验组EP管做3个平行组。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合[4];（2）混合均匀后，取200ul混合液，在酶标仪上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂[4]。3.3.4总蛋白质的测定：实验步骤（1）取35%白酒、40%白酒、45%白酒、52%白酒、56%白酒、生理盐水、维生素C各200ul分别加入细胞培养板中，然后每个培养板个加入DEAM高糖培养基2ml、胎牛血清60ul、双抗10ul、细胞液200ul，每个浓度梯度分别做3个平行组，置于CO2培养箱中，分别培养24h、48h、72h；（2）染毒完成后，将细胞培养板从CO2培养箱中取出，用移液枪小心吹打细胞培养板底部，使贴壁细胞从细胞培养板中脱落，轻微振荡混匀，然后从每个细胞培养板取适当浓度的细胞悬液体积500ul细胞培养液于1.5mlEP管中；（3）细胞破碎：放置-20℃冰箱内，10min然后37℃孵育5min，反复冰融3次，然后再进行超声波破碎20min;（4）再以4000rpm/min，离心15分钟，分取100ul上清液,加入考马斯亮兰5ml,加入后立即振荡混匀，在595nm下测定的吸光度值A595；3.3.5标准曲线的制作：管号1234567标准蛋白质（1.0mg/ml）00.010.020.040.060.080.10蒸馏水0.10.090.080.060.040.020考马斯亮蓝G－250试剂5.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白质量（g）光吸收值（A595）00.0510.0980.1560.2280.2900.360实验组：培养24h24h白酒浓度OD值平均值蛋白质浓度35%0.3420.3320.3330.3360.09240%0.4140.4210.4110.4150.11445%0.4160.4180.4240.4190.11652%0.5040.4940.5030.5000.13956%0.4410.4420.4380.4400.122生理盐水0.3720.3720.3600.3680.101维生素C0.3200.3440.3450.3360.093培养48h48h白酒浓度OD值平均值蛋白质浓度35%0.3310.3150.3390.3280.09040%0.2830.2830.2780.2810.07645%0.2920.2950.2960.2940.0852%0.3180.3160.3090.3140.08656%0.3080.3000.3020.3030.083生理盐水0.2790.2880.2920.2860.078维生素C0.3470.3410.3530.3470.095培养72h72h白酒浓度OD值平均值蛋白质浓度35%0.3130.3140.3050.3110.08540%0.3230.3290.3090.3200.08645%0.30.2990.2940.2980.08152%0.3420.3280.3260.3320.09156%0.2950.3070.3030.3020.082生理盐水0.2740.2840.2730.2770.075维生素C0.3610.3340.3450.3470.0953.4测定不同酒精度白酒对细胞内丙二醛含量的影响3.4.1检测方法：①配制0.6%TBA溶液（称TBA0.6g，加入1mol/L的NaOH1-2ml，溶解于10%的三氯乙酸(TCA)，定容为100ml）,如果TBA未完全溶解，可加热（小于65℃），至TBA完全溶解。试剂：硫代巴比妥酸（TBA），三氯乙酸(TCA)，现用现配。3.4.2实验步骤：（1）取细胞悬液0.5ml，放置-20℃冰箱内，10min然后37℃孵育5min，反复冰融3次，再进行超声波破碎20min，以使细胞破碎完全；（2）用离心机以4000rpm/min，离心15分钟；（3）取上清液0.5ml，再加入2ml0.6%TBA溶液，95℃40min或者沸水浴20min，至粉红色取出后；（4）流水冷却，取0.5ml，4000rpm，10min，4℃离心[4]。（5）取200ul上清液，测（532nm，600nm，450nm）OD值，并做好记录。然后根据计算公式：C（MDA）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450单位：umol/ml（6）再根据样品中蛋白含量计算MDA含量：样品中MDA含量=MDA浓度/样品中蛋白质含量。最后单位转化成nmol/mg*Prot。培养24h24h白酒浓度OD值（532）平均值C(MDA)35%0.1260.1230.1240.1240.61840%0.0180.0120.0160.0150.04145%0.0110.0060.0090.009-0.00252%0.0190.0250.0190.0210.04256%0.0240.0220.0230.0230.058生理盐水0.0160.0140.0180.0160.030维生素C0.0250.0190.0220.0220.07924h白酒浓度OD值（600）平均值35%0.0190.0220.0160.01940%0.0040.0040.0050.00445%0.0050.0040.0060.00552%0.0090.010.0070.00956%0.0060.0080.0060.007生理盐水0.0050.0050.0060.005维生素C0.0030.0030.0040.00324h白酒浓度OD值（450）平均值35%0.1140.1090.0960.10640%0.0570.0490.0550.05445%0.0510.0480.050.05052%0.0680.0590.0630.06356%0.0850.0730.0820.080生理盐水0.0760.0740.0680.073维生素C0.0710.0840.0750.077培养48h48h白酒浓度OD值（532）平均值35%0.0980.1130.1050.1050.49940%0.0270.0170.0210.0220.07245%0.0230.0230.0240.0230.09652%0.0220.0210.0210.0210.02256%0.0160.0180.0190.0180.059生理盐水0.0230.0250.0260.0250.074维生素C0.0200.0210.0230.0210.07948h白酒浓度OD值（600）平均值35%0.0120.010.010.01140%0.0040.0030.0040.00445%0.0040.0040.0020.00352%0.0140.0090.0120.01256%0.0020.0030.0020.002生理盐水0.0080.0060.0070.007维生素C0.0020.0010.0020.00248h白酒浓度OD值（450）平均值35%0.1930.1900.1890.19140%0.0810.0780.0760.07845%0.0570.0620.0580.05952%0.0630.0690.0590.06456%0.0850.0730.0790.079生理盐水0.0760.0790.0740.076维生素C0.0710.0840.0750.077培养72h72h白酒浓度OD值（532）平均值35%0.050.0440.0450.0460.15740%0.0120.010.0120.011-0.03345%0.0150.0130.0160.0150.04152%0.0080.0070.0060.007-0.00756%0.0080.0090.0100.009-0.015生理盐水0.0060.0070.0080.007-0.021维生素C0.0030.0030.0040.003-0.03972h白酒浓度OD值（600）平均值35%0.0090.0090.0080.00940%0.0150.0110.0130.01345%0.0050.0050.0050.00552%0.0030.0030.0020.00356%0.0100.0070.0060.008生理盐水0.0060.0050.0060.006维生素C0.0050.0040.0050.00572h白酒浓度OD值（450）平均值35%0.1530.140.1420.14540%0.0310.0420.0340.03645%0.0420.040.0440.04252%0.0320.0380.0360.03556%0.0420.0410.0440.042生理盐水0.0500.0560.0520.053维生素C0.0560.0510.0540.0543.5测定不同酒精度白酒对Hepg2细胞内过氧化氢酶活力的影响3.5.1试剂组成与配制：试剂一：液体100ml×1瓶，4℃保存6个月。试剂二：底物液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。加双蒸水至100ml溶解，4℃保存1个月。（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四：液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。3.5.2实验步骤：取细胞悬液0.5ml，放置-20℃冰箱内，10min然后37℃孵育5min，反复冰融3次，再进行超声波破碎20min，用离心机以4000rpm/min，离心15分钟，取上清液进行测定，按下方操作表进行试剂添加。操作表：空白对照管测定管上清液（ul）10试剂一(37℃预温)（ul）200200试剂二(37℃预温)（ul）2020混匀，37℃准确反映60s试剂三（ul）200200试剂四（ul）2020上清液（ul）10混匀，波长405nm，双蒸水调零，测定各管吸光度值培养24h24h白酒浓度OD值（405）平均值蛋白质浓度CAT活力35%0.4960.4930.4730.4870.092229.27540%0.450.4470.4360.4440.121334.95345%0.5510.4760.5230.5170.11667.54052%0.4570.4670.4630.4620.139233.04656%0.4450.4460.4890.4600.122274.164生理盐水0.4820.4850.4780.4820.101234.205维生素C0.4830.4760.5030.4870.093226.810培养48h48h白酒浓度OD值（405）平均值蛋白质浓度CAT活力35%0.4540.5020.4780.4780.09281.24440%0.4690.4770.4840.4770.076340.98245%0.4670.4850.4740.4750.08331.46752%0.470.4830.4620.4720.086327.61256%0.4450.4650.4540.4550.083432.032生理盐水0.4710.4860.4820.4800.078314.855维生素C0.4480.4350.4670.4500.095399.6633.6.测量不同酒精度白酒对细胞内钙调蛋白含量的影响3.6.1通过测量Ca2+浓度变化来间接测量钙调蛋白的含量变化3.6.2实验步骤（1）用不同酒精度白酒处理Hepg2细胞24h、48h、72h；（2）取0.5ml细胞培养液，1000g离心，10min收集细胞；（3）倒掉上清液，用HBSS溶液洗涤3遍；（4）加入Fluo4-AM-T工作液，37℃培养30min；（5）再用HBSS溶液洗涤3遍，然后加入HBSS溶液覆盖细胞，37℃培养箱中培养30min，弃去HBSS溶液；（6）每组加50ul胰酶消化，再加入450ulPBS，振荡混匀，测定各组细胞荧光强度，对照组加等量的PBS，激发波长为494nm，发射波长为516nm[8]。培养24h24h白酒浓度平均值PBS0.27535%0.6950.7060.7220.70840%0.9330.940.9210.93145%0.8650.8620.8590.86252%0.3900.3920.4010.39456%0.6040.6090.5850.599生理盐水0.4580.4690.4270.451维生素C0.6140.6090.5980.607培养48h48h白酒浓度平均值PBS0.27535%0.7490.7640.7580.75740%0.5780.5490.5680.56545%0.4480.4170.4440.43652%0.8010.8060.8140.80756%0.9851.0131.0221.007生理盐水0.3580.3840.3950.379维生素C0.7590.7950.7640.773培养72h72h白酒浓度平均值PBS0.27535%0.8280.7590.7980.79540%0.7240.7210.7480.73145%0.6910.6960.6720.68652%0.6870.6650.670.67456%0.4910.5030.5080.501生理盐水0.5170.5200.52040.519维生素C0.6180.6060.6230.6163.7测量不同酒精度白酒对细胞内Caspase-8活性的影响3.7.1实验药品（以下药品来自于试剂盒）1.裂解缓冲液2.反应缓冲液3.底物4.10mM标准品pNA3.7.2实验步骤：（1）取35%白酒、40%白酒、45%白酒、52%白酒、56%白酒、生理盐水、维生素C各200ul分别加入细胞培养板中，然后每个培养板个加入DEAM高糖培养基2ml、胎牛血清60ul、双抗10ul、细胞液200ul，每个浓度梯度分别做3个平行组，置于CO2培养箱中，分别培养24h、48h；（2）染毒完成后，将细胞培养板从CO2培养箱中取出，用移液枪小心吹打细胞培养板底部，使贴壁细胞从细胞培养板中脱落，轻微振荡混匀，然后从每个细胞培养板取适当浓度的细胞悬液体积500ul细胞培养液于1.5mlEP管中；（3）1000g5min收集细胞，吸尽上清；（4）加入100ul裂解液振荡裂解，冰浴10min，再次振荡；（5）4℃12000g10min，取上清测定。3.7.3测定pNA标准曲线：取反应缓冲液稀释10mMpNA标准品为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125uM。设置不加pNA的零管；每一浓度取100ul加入96孔板，用酶标仪测定OD405吸光度；（3）以每一浓度标准管OD405值为x轴，对于的pNA浓度为y轴，3.7.4制作pNA浓度对OD405值的标准曲线pNA012.52550100200OD值00.0070.0140.0270.0510.0923.7.5样品测定操作：（1）按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同，设置不加样品的空白对照管；（2）用盖子将加入试剂的96孔板盖紧，37℃反应2小时；（3）样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物的产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量。无样品空白对照高酶活性样品反应缓冲液ul9585待测样品ul010底物ul55总体积ul1001003.7.6实验结果培养24h24h白酒浓度OD值（405）平均值对照组0.05535%0.0620.0620.0630.06213.33%40%0.0630.0640.0640.06415.76%45%0.0620.0610.060.06110.91%52%0.0650.0710.0780.07129.70%56%0.0650.0650.0660.06518.79%生理盐水0.0640.0600.0640.06313.94%维生素C0.0650.0660.0660.06619.39%培养48h48h白酒浓度OD值（405）平均值对照组0.05535%0.0620.0570.0580.0597.27%40%0.0630.0640.0650.06416.36%45%0.0650.0710.0680.06823.64%52%0.0660.0650.0610.06416.36%56%0.0600.0730.0650.06620.00%生理盐水0.0610.0560.0580.0586.06%维生素C0.0600.0620.0610.06110.91%4结果与讨论4.1细胞活力4.2总蛋白质4.3MDA4.4过氧化氢酶活力4.5钙离子含量4.6Caspase-8活性参考文献:[1]钟石,李有贵,林天宝,吕志