深圳大学理科选修《遗传学发现》课件7重组DNA

重组DNA大肠埃希菌俗名大肠杆菌是人和动物肠道中最主要的细菌之一是正常菌群的成员出生后数小时就进入肠道，并伴随终生能合成维生素B和K，供人体利用能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）真菌（如白念珠菌）的过度增殖异位寄居时可引起肠外感染某些菌株有致病性—消化道感染，导致腹泻等每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个可作为粪便污染的检测指标常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究基因工程的工具菌卫生细菌学检查大肠菌群指37OC24h内发酵乳糖产酸产气包括埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属等大肠菌群指数指1000ml被检样品中的大肠菌群数生活饮用水的水质标准coli-index≤3个我国2007年开始实施的卫生标准规定每100ml生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希菌

1、细菌培养--平板培养划线法培养涂布法培养大肠杆菌的培养限制性内切酶EcoRI内切酶限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀限制—修饰现象Kλ（B）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制Kλ（K）存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制EOP:Efficiencyofplating（生长在不同寄主中的λ噬菌体的成斑率，表示限制程度）说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA；10-4的存活率是由宿主限制系统作用的结果产生这种现象的原因何在甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从而使自身核酸免受内切酶水解——细菌的“防御”系统核酸内切酶：识别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护）研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶限制修饰在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA等），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；

而宿主细胞自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。限制—修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。分类核酸外切酶核酸内切酶核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消化降解核苷酸从核酸链分子内部切割3’，5’磷酸二酯键，使之断裂形成小片段核酸内切酶：按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情况不同，分三类（I，II，III），通常指的是II型。

命名法HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如从流感嗜血杆菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后发现3种限制性酶，则分别命名为HindI，HindII，HindIII大肠杆菌R菌株REscherichia嗜血流感杆菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型号）种名的头两个字母宿主属名的第一个字母coli前3个字母代表来源的生物随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序

质粒质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。莱德伯格（1925~2008），美国遗传学家。细菌遗传学的创始人之一。1925年5月23日生于美国蒙特克莱市。1944年获哥伦比亚大学学士学位，以后曾在医学院学习，不久转入耶鲁大学，于1947年获博士学位。1959年起任斯坦福医学院教授兼遗传学系主任。1962年任肯尼迪分子医学实验室主任。他在耶鲁大学期间，发现细菌的遗传重组。1946年，他和E.L.塔特姆发现遗传重组的普遍性。1952年发现细菌的F因子。1952年发现沙门氏菌中的普遍性转导，1953年发现大肠杆菌的温和噬菌体λ在染色体上占有一定位置。1956年发现λ噬菌体能进行局限性转导。他们的研究工作还包括应用细菌的有性生殖和转导进行细菌的免疫学和代谢作用等方面的研究。

1958年他和G.W.比德尔和E.L.塔特姆共同获得诺贝尔生理学或医学奖。接合现象的发现接合：指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体转移到受体并发生重组的过程。1946年莱德伯格和塔特姆发现了细菌的接合。这种野生型细胞如何出现的？U型管实验：A、B菌株分别培养在基本培养基上一边加压和吸引使培养液充分混合结果任何一臂的培养基上均未长出野生型细菌。结论：菌株A与菌株B细胞直接接触（接合）是野生型细胞出现的必要条件；两菌株直接接触后导致遗传物质转移，进而发生基因重组，产生野生型细菌。试验证明：接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质

B菌株，从供体到受体。用大肠杆菌K12的菌株A和菌株B，首先用高剂量的链霉素处理菌株A或菌株B，把处理过的菌株A跟未处理过的菌株B混合，或把处理过的菌株B跟未处理过的菌株A混合，发现结果大不相同：⑴F因子：致育因子或称性因子，是一种附加体。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表示。F因子及F＋向F－的转移⑵F因子的结构染色体外遗传物质（质粒），环状DNA，9×104bp，大约为大肠杆菌环状染色体的2%，具有40~60个蛋白质基因。每个细胞（F＋）有2~4个。⑶F因子的三种状态②有一个自主状态的F因子，即F＋细胞；

③带有一个整合的F因子的细胞叫高频重组细胞，Hfr细胞。①没有F因子，即F－细胞；

F＋与F－菌（1）有F因子的细菌称为F＋，细菌增殖时可把F

因子传递给后代细胞（通过自主复制）。（2）没有F因子的细菌称为F－，F＋细菌经吖啶橙处理而丢失，成为F－。F因子一经丢失，细胞中便不再出现；（3）F＋可以和F－杂交，而不能和F＋杂交；（4）F＋菌与F－菌混合（即F＋×F－）1小时后，约95%的F－菌转变为F＋菌，而原来的F＋仍然保留有F因子。分子克隆pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ’）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCS蓝白斑筛选重组子的原理：

lacZ’编码β半乳糖苷酶的α肽，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）被分解产生蓝色。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因而携带外源基因的重组子菌落呈白色。利用菌落颜色筛选重组子PUC质粒载体的优点：基因组小，拷贝数高，DNA产量高；有LacZ筛选标记，LacZ基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳性克隆；有MCS，其中有13个以上的单一限制位点，可用于外源基因克隆。意义与应用

重组DNA技术的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大